Stato dell’arte
L’eziologia della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è complessa e, nonostante la sua incidenza, ancora da chiarire.

Cosa aggiunge questo studio
Scopo dello studio è stato indagare il ruolo del microbiota, di Klebsiella pneumoniae in particolare, nello sviluppo di NAFLD, oltre che individuare un possibile biomarcatore diagnostico.

Conclusioni
Per alcune forme di NAFLD, la presenza di ceppi di K. Pneumoniae associati alla produzione endogena di alcol sembrerebbe essere tra i principali fattori eziologici. Inoltre, una sua combinazione con una dieta ad alto contenuto di grassi potrebbe aggravare il decorso della malattia. Lo studio suggerisce infine che la concentrazione alcolica ematica possa essere utilizzata come un valido biomarcatore diagnostico.

Alcuni ceppi di Klebsiella pneumoniae potrebbero essere tra i principali fattori eziologici di alcune malattie epatiche, tra cui la steatosi epatica non alcolica, in quanto in grado di favorire la produzione endogena di alcol e il conseguente danneggiamento dell’organo. La presenza di questi batteri, associata a una dieta ad alto contenuto di grassi, sembrerebbe inoltre aggravare il decorso della malattia. Il monitoraggio dei livelli alcolici ematici potrebbe rappresentare una valida strategia diagnostica.

Lo hanno dimostrato Jing Yuan e colleghi del Center for Disease Control and Prevention di Bejing (China) in un ampio studio pubblicato di recente su Cell Metabolism.

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è solo una delle patologie da fegato grasso (FLD), a sua volta differenziabile in varie forme. Nonostante sia stato dimostrato una sua diretta associazione con obesità, sindromi metaboliche o da insulino resistenza, dislipidemia e disbiosi, i meccanismi che ne stanno alla base rimangono ancora da chiarire. Per quanto riguarda per esempio il ruolo del microbiota, in casi di NAFLD è stato registrato un arricchimento di Eubacterium rectale o Bacteroides vulgates. L’elevata inter-variabilità e le differenti vie metaboliche coinvolte indicano però la necessità di approfondire l’esatto contributo dei batteri nello sviluppo di questa patologia.

A tal proposito, i ricercatori hanno valutato il ruolo di alcuni ceppi di Klebsiella pneumoniae considerando la sua correlazione con la produzione endogena di alcol dimostrata in soggetti con steatoepatite non alcolica grave (NASH) e/o sindrome della fermentazione intestinale (ABS) e il miglioramento clinico in seguito a terapia antibiotica. La produzione endogena di alcol potrebbe infatti essere una concausa di NAFLD e i livelli alcolici ematici (BAC) essere quindi utilizzati come marcatore diagnostico o di monitoraggio terapeutico.

Per testare questa ipotesi, campioni fecali e istologici sono stati raccolti da opportuni modelli murini di NAFLD, NASH/ABS e controlli sani, oltre che da una coorte di soggetti rappresentativi (NAFLD n=43; NASH n=32; ABS n=11) e controlli sani (n=48).  Di seguito i principali risultati.

I ceppi HiAlc Knp possono causare steatosi epatica non alcolica

Dopo aver isolato da soggetti con NASH/ABS due ceppi di Klebsiella pneumoniae (W14 e TH1) in grado di produrre elevate quantità di alcol (high alcohol-producing Klebsiella pneumoniae, HiAlc Knp), si è proceduto con la validazione della loro correlazione con NAFLD monitorando la produzione alcolica:

• l’abbondanza fecale di ceppi HiAlc Knp è risultata leggermente maggiore nei soggetti con NAFLD e NASH rispetto ai controlli. Differenza più marcata nella capacità di produzione alcolica, che è risultata nettamente superiore nei gruppi di pazienti, suggerendo una relazione ceppo-specifica
• la presenza nei campioni fecali di ceppi a media e alta capacità di produzione alcolica (MedAlc e HiAlc) è stata riscontrata nel 61% dei soggetti con NAFLD, solo nel 6,25% dei controlli. Una netta riduzione è stata invece riscontrata in seguito a remissione della malattia.

Al fine di approfondire il legame tra i ceppi HiAlc Knp e le FLD, modelli murini SPF (specific-pathogen free) sono stati trattati con i ceppi in questione (HiAlc Knp), etanolo o soluzione al 10% di etanolo (YPD) per 4, 6 e 8 settimane. Dall’analisi istologica e biochimica si è visto che nei gruppi trattati con HiAlc Knp ed etanolo rispetto a quello con YDP:

• è stata sviluppata una chiara micro- e macro-steatosi a 4 e 8 settimane, oltre che un cambiamento morfologico dei villi intestinali
• è stato registrato un significativo incremento sierico di aspartato e alanina transaminasi (AST, ALT), di trigliceridi e sostanze reattive all’acido triobarbiturico (TBARS) nel fegato e di diammine ossidasi (DAO) e D-lattato (D-LA) nell’intestino
• è stato registrato un innalzamento dell’espressione di CYP2E1, essenziale per il metabolismo dell’etanolo, oltre che di 10 geni coinvolti nella lipogenesi e dei recettori PPARalpha epatici dopo 6 settimane
• è stato registrato un aumento del numero di foci infiammatori, neutrofili, macrofagi, linfociti T e B, ma non di monociti e linfociti NK (natural killer).

Nel gruppo HiAlc Knp rispetto a quello con etanolo è stato inoltre registrato un ulteriore aumento di CD4+, cellule dendritiche, neutrofili e macrofagi, suggerendo come altri metaboliti derivanti dai batteri possano aggravare il quadro clinico rispetto al solo etanolo.

Se la risposta immunitaria del gruppo HiAlc Knp viene invece confrontata con quello YDP, è possibile apprezzare un significativo innalzamento dei linfociti Th17 (CD4+ IL-17) rispetto a Th1 e Th2 localizzato nel fegato. Il contributo dei Th17 indotti da HiAlc Knp nello sviluppo di NAFLD è stato quindi confermato con la somministrazione di anti-IL-17, registrando un notevole miglioramento della steatosi.

Riguardo la dinamica e la velocità di sviluppo di steatosi indotta dai ceppi HiAlc Knp o da etanolo è stato invece dimostrato che:

• nello stadio iniziale (4 settimane) pathways legati all’accumulo di grasso epatico, come la differenziazione degli osteclasti e il metabolismo del retinolo o dell’acido arachidonico, sono risultati aumentati
• l’arricchimento a 6 e 8 settimane della biosintesi di acidi grassi insaturi, del metabolismo di glicerolipidi e retinolo e delle vie di segnalazione FoxO e PPAR indica la progressione del quadro clinico in steatosi epatica
• lo stato infiammatorio e i geni coinvolti nel catabolismo alcolico hanno mostrato anch’essi un parziale incremento.

Il meccanismo d’azione dei ceppi HiAlc Knp

L’attenzione si è dunque spostata sui meccanismi molecolari di steatosi analizzando gli effetti dei ceppi HiAlc Knp (W14 e TH1) su cellule di epatocarcinoma (HepG2). I ricercatori hanno osservato:

• un aumento di trigliceridi intracellulari
• cambiamenti nella morfologia cellulare verso condizioni tipiche per steatosi
• un danneggiamento dei mitocondri sostenuto da un’alterazione dell’integrità di membrana e del DNA e dell’attività GTPasica, oltre che da accumulo di specie reattive dell’ossigeno e perossidazione lipidica.

Modelli murini germ-free sono stati poi utilizzati per meglio indagare l’essenzialità dei ceppi HiAlc Knp nello sviluppo di FLD:

• la colonizzazione batterica è risultata elevata a 8 settimane
• con l’analisi istologica sono stati rilevati chiari segni di steatosi epatica, il che suggerisce come la produzione endogena di alcol da parte di questi ceppi sia sufficiente a indurre FLD
• è stato registrato un incremento significativo dei livelli di AST, ALT, TBARS e trigliceridi rispetto al gruppo controllo.

Si è dunque proseguito con il trapianto di microbiota fecale. Nel dettaglio:

• modelli germ-free sono stati colonizzati con il microbiota di pazienti NASH con i ceppi HiAlc Knp (gruppo 1)
• modelli wild-type con quello di modelli NAFLD (gruppo 2)
• altri modelli wild type con quello di modelli NAFLD modificati per non esprimere Knp W14 e TH1 (gruppo 3).

Dai dati ottenuti è emerso che:

• nel primo e secondo gruppo, segni di steatosi sono stati riscontrati già a 4 settimane, con ulteriore progressione a 8 settimane
• a livello epatico nessun cambiamento grasso-correlato significativo è risultato nel terzo gruppo
• l’abbondanza dei ceppi HiAlc Knp è risultata associata alle caratteristiche della patologia sia nei donatori sia nei riceventi, dati confermati dalla valutazione istologica.

Tutti i ceppi HiAlc Knp isolati sono suscettibili a trattamento con imipenem. A ulteriore conferma del ruolo di tale batterio nello sviluppo di NAFLD, una settimana di trattamento antibiotico mirato ha migliorato notevolmente il quadro clinico, proponendosi come strategia di intervento in caso di NAFDL da Knp.

L’analisi in vivo

I ricercatori hanno quindi ampliato la valutazione in vivo includendo, oltre a W14 e TH1, anche altri ceppi di Knp dalle diverse proprietà alcol-inducenti, ossia F0037 (alto livello di alcol prodotto), F0029 e F0039 (medio), H0018 (basso). Dai risultati ottenuti è emerso che:

• i modelli murini trattati con F0037 hanno presentato cambiamenti morfologici e induzione di steatosi già a 4 settimane (andamento simile a W14 e TH1), quelli riceventi i ceppi a medio “potere alcolico” invece a 12
• H0018, contrariamente agli altri ceppi, non ha indotto alterazioni epatiche significative
• il trattamento con ceppi HiAlc ha prodotto un aumento della risposta infiammatoria e un’alterazione dell’integrità e della permeabilità della barriera intestinale in maniera analoga all’alcol esogeno.

Accompagnando poi la somministrazione di HiAlc Knp a una dieta ad alto contenuto di grassi, fattore predisponente noto per patologie FLD, si è registrato un ulteriore peggioramento legato soprattutto alla disfunzione mitocondriale e alla risposta immunitaria con un aumento in particolare dell’espressione di chemochine e linfociti Th2.

I livelli ematici di etanolo (BAC) sono un possibile biomarcatore per FLD

Da ultimo, data la difficoltà di una diagnosi precoce, oltre che differenziale, nei confronti delle altre FLD, i ricercatori hanno valutato la possibilità di utilizzare i livelli di etanolo ematici (BAC) come biomarcatore. I valori BAC sono quindi stati registrati dopo la somministrazione dei ceppi HiAlc Knp o di etanolo (controllo positivo), registrando nel primo caso livelli trascurabili, nel secondo invece tali da inebriare. Dal momento che il glucosio è il substrato fisiologico del metabolismo alcolico, una soluzione al 10% di glucosio è stata somministrata al gruppo colonizzato con ceppi HiAlc Knp, facendogli raggiungere valori massimi di BAC a 2 ore (111,16 mmol/L per W14; 75,65 mmol/L per TH1) e l’inebriamento a 4 ore.

Interessante notare come nei modelli colonizzati le concentrazioni di etanolo nella vena porta siano il doppio di quelle registrate nelle vie periferiche, mentre i valori BAC del gruppo in YDP e trapiantato siano trascurabili in entrambi i casi.

Risultati simili sono stati osservati anche nei pazienti. I valori BAC medi in soggetti NASH e NAFLD sono infatti risultati notevolmente superiori rispetto ai controlli sani (4,00 mg/L e 2,24 mg/L vs 0,62 mg/L). Si osserva un miglioramento per i pazienti con NASH in remissione (1,12 mg/L). Il monitoraggio di BAC in seguito a somministrazione di glucosio potrebbe quindi rappresentare un valido strumento per l’individuazione dei ceppi HiAlc Knp, facilitando di conseguenza la diagnosi di FDL.

In conclusione, dunque, alcuni ceppi di K. Pneumonia molto attivi nel metabolismo alcolico sembrerebbero sufficienti per indurre alcune delle patologie da fegato grasso, NAFDL in particolare. Data la responsività, il monitoraggio delle concentrazioni alcoliche ematiche in seguito a somministrazione del substrato glucidico potrebbe rappresentare un valido strumento diagnostico finalizzato all’individuazione dei ceppi in questione.

Trattandosi tuttavia di patologie complesse e molto diversificate, ulteriori approfondimenti sono necessari al fine di delineare meglio il contributo dei ceppi HiAlc Knp e la validità del biomarcatore proposto.