Uno studio pubblicato su PNAS rivela il meccanismo alla base della protezione gastrointestinale attuata dagli inibitori della beta-glucuronidasi batterica (GUS), mediante studi in vivo. È emerso che l’inibizione mirata di questi enzimi sembra attenuare i danni causati nel tratto intestinale da irinotecan, un farmaco usato per il trattamento di diversi tumori solidi che ha come effetto collaterale maggiore la diarrea.

Irinotecan e tossicità gastrointestinale

Il meccanismo d’azione dell’irinotecan consiste nell’inibire la topoisomerasi I, che in vivo diventa SN38. La crescita incontrollata delle cellule tumorali viene rallentata dell’epitelio intestinale. L’SN38 viene poi detossificato grazie all’aggiunta di una molecola di acido glucuronico, diventando così SN38-G: poi così contrassegnato, questo composto viene eliminato nel tratto gastrointestinale (GI).

Gli enzimi GUS dei batteri commensali rimuovono l’acido glucuronico dall’SN38-G. Nei modelli animali, dopo riattivazione, l’SN38 provoca danni epiteliali che causano diarrea sanguinante e una drastica perdita di peso.

Gli autori analizzano tre argomenti fondamentali relativi all’utilizzo in vivo di inibitori di GUS per curare la tossicità intestinale causata da irinotecan:

– la velocità con cui il farmaco causa tossicità nel tratto GI, stabilendo che anche una singola dose di inibitori riesce ad alleviare i sintomi dei primissimi danni intestinali;

– il grado di potenziamento dell’efficacia dell’attività dell’antitumorale grazie all’uso degli inibitori, in due modelli murini;

– l’impatto della combinazione irinotecan+inibitori sulla composizione del microbiota intestinale murino.

Questi dati, quindi, rappresentano una prima comprensione del meccanismo attraverso cui inibitori di enzimi batterici tipici del tratto GI mitigano danni indotti da farmaco e migliorano l’efficacia del chemioterapico stesso.

Le centinaia di enzimi GUS batterici mappati ad oggi sono stati classificati in 6 diversi gruppi funzionali sulla base dell’architettura del sito attivo. I GUS sono codificati dai Bacteroides, Firmicutes e Proteobacteria; tra queste famiglie, i Proteobacteria sono gli unici ad esprimere solo gli ortologhi del Loop1.

Gli autori hanno scoperto che gli enzimi con solo questo L1 riescono a processare più efficacemente l’SN38-G. E che l’inibitore UNC10201652 è il migliore nell’inibire la riattivazione di l’SN38-G mediata da GUS, in vitro. La struttura cristallografica di questo inibitore in complesso con l’L1 del GUS, e dei suoi ortologhi, nel Clostridium perfringens lo conferma.

L’inibizione degli enzimi GUS “In fimo”

Oltre all’analisi condotta in vitro, gli autori hanno descritto anche un’analisi “in fimo” per raccontare l’esperimento condotto su campioni di feci.

“In fimo” deriva dal latino fimus ovvero escremento. Il processamento dell’SN38-G negli esperimenti in fimo avviene nei composti prodotti nell’intestino cieco e nel retto, di topi FVB trattati con irinotecan.

Anche in questi esperimenti l’UNC10201652 risulta l’inibitore più efficace nel bloccare l’attività degli enzimi GUS.

I topi FVB trattati con irinotecan, UNC10201652, o entrambi sono stati esaminati nella riattivazione dell’SN38-G in fimo dopo 24h: già una sola infiltrazione di irinotecan fa aumentare considerevolmente l’attività di idrolisi dell’SN38-G nel cieco.

Inibire gli enzimi GUS previene i danni all’intestino

L’inibizione degli enzimi GUS batterici non altera comunque la farmacocinetica dell’irinotecan o dei suoi metaboliti chiave all’interno del siero murino. Al fine di determinare se un enzima GUS L1 (come per esempio quella di Escherichia Coli) riesce a limitare danni intestinali prodotti dal farmaco, gli autori hanno incrociato topi wild type con topi asettici oppure con topi isogenici in cui il gene GUS è stato deleto (ΔGUS).

Si è visto che in fimo una sola dose di irinotecan aumenta l’attività batterica della GUS in topi wild type colonizzati da E.coli ma non in quelli ΔGUS: somministrando ripetutamente il farmaco ai primi si assiste a un aumento significativo della lipocalina-2 fecale, sostanza che indica infiammazione e danno intestinale.

Inoltre, questi topi mostrano anche una marcata riduzione della proliferazione delle cellule epiteliali confrontati a quelli ΔGUS. Quindi, gli enzimi GUS microbici intestinali riescono a limitare i danni al tratto GI causati dall’irinotecan e a ridurre la proliferazione delle cellule epiteliali enteriche.

In seguito gli autori hanno indagato anche se inibitori di GUS batterici somministrati oralmente fossero capaci di raggiungere il tratto GI intatti, dal momento che questi si ritrovano in tutti i compartimenti intestinali: i risultati dimostrano che anche la somministrazione orale fa sì che gli inibitori svolgano la loro funzione raggiungendo la destinazione corretta.

Poi è stato condotto un esperimento in “time course” in due diverse coorti contenenti quattro gruppi diversi di topi FVB divisi per età, peso, femmine con cuccioli e trattati con una singola dose di veicolo, o di inibitori di GUS, o di irinotecan o di irinotecan più inibitori.

Dai risultati è emerso che a 24h dal trattamento non si osserva nessuna differenza tra i vari gruppi; a 120h, invece, si osserva che una singola dose di farmaco fa diminuire significativamente i livelli proliferativi cellulari nell’ileo, nel colon prossimale e distale, effetti che vengono bloccati dalla somministrazione di un’unica iniezione di inibitore.

Quindi, gli inibitori delle GUS batteriche riescono a bloccare gli effetti dell’irinotecan già dopo un giorno e a ridurre i danni epiteliali sulla proliferazione già in 5 giorni dall’iniezione.

L’inibizione degli enzimi GUS in modelli preclinici xenograft

Gli autori hanno in seguito testato gli effetti degli inibitori sull’efficacia del farmaco antitumorale in vivo, utilizzando modelli preclinici xenograft di carcinoma della mammella. Le cellule iniettate in topi nudi atimici immuno-deficienti scelte dagli autori sono le SUM149, corrispondenti a tumore al seno triplo negativo.

Dopo aver fatto sì che i tumori nei topi diventassero visibili e palpabili, gli animali sono stati randomizzati in quattro diversi gruppi:

1- controllo

2- inibitori di GUS

3- irinotecan 50mg/kg

4- combinazione di irinotecan+ inibitori della GUS

Dal punto di vista clinico, soltanto pochi animali trattati con la combinazione (gruppo 4) hanno manifestato diarrea, dimostrando quindi che la somministrazione di farmaco+inibitore riesce ad alleviare questo sintomo come anche quello della perdita di peso.

Inoltre, sia il gruppo 3 che il 4 presentavano delle masse tumorali parecchio ridotte se confrontate con quelle dei gruppi 1 e 2, suggerendo quindi che gli inibitori riescono effettivamente a proteggere l’intestino dai danni epiteliali causati dal farmaco antitumorale in topi immunodeficienti.

Allo scopo di prendere in considerazione un’eventuale riduzione graduale di farmaco, gli autori hanno deciso di utilizzare topi GEMM (C3Tag geneticamente modificati) caratterizzati da un sistema immunitario intatto. Non appena i tumori sono diventati visibili e palpabili, gli animali sono stati randomizzati in un unico gruppo partendo dai quattro precedenti.

Il farmaco antitumorale irinotecan è stato somministrato utilizzando un programma di intensificazione più rigido: anche in questo caso gli inibitori sono stati capaci di alleviare i sintomi della malattia (diarrea). La perdita di peso ha riguardato i topi trattati con solo irinotecan e quelli trattati con la combinazione. Anche se in quelli trattati con combo, questa perdita di peso è stata solo iniziale, in quanto essi hanno riacquistato peso nelle settimane successive: questo suggerisce quindi che la combinazione permette una maggiore sopravvivenza, oltre ad evitare perdita di peso.

Inoltre, anche la rigenerazione epiteliale sembra trarre giovamento dalla combinazione, come rivelato dall’analisi al microscopio di tessuti prelevati dal colon. Perciò, nonostante l’intensificazione della terapia con irinotecan, i topi che ricevono anche gli inibitori oltre all’antitumorale, mostrano una riduzione dei danni epiteliali e un miglioramento del peso rispetto ai topi trattati con solo irinotecan.

Espansione intestinale degli Enterobacteriaceae in topi nudi

I risultati del sequenziamento condotti sui contenuti derivati dal colon di topi atimici immuno-deficienti con tumore alla mammella triplo negativo mostrano una significativa diminuzione della diversità alfa in topi trattati con solo irinotecan, mentre i topi trattati con la combo non mostrano diversità alfa diversa da quella dei topi controllo o quelli trattati con soli inibitori: questi dati quindi indicano che gli inibitori dati insieme al farmaco antitumorale migliorano le specie microbiche intestinali, tenendo costante la alfa diversità.

Inoltre, sempre i risultati del sequenziamento rivelano che:

– l’irinotecan causa una sorprendente espansione dei Proteobacteria nel microbiota intestinale;

– nel contenuto del tratto luminale nei topo trattati col solo veicolo si ritrova il 52% di Bacteroidetes, il 41% di Firmicutes e il 4% di Proteobacteria;

– nei topi trattati col solo irinotecan si registra un drammatico aumento di Proteobacteria, fino al 68% e una diminuzione di Firmicutes e Bacteroidetes;

– l’inibitore degli enzimi batterici GUS da solo provoca nei topi trattati una riduzione dei livelli di Proteobacteria.

Quindi, nei topi immunodeficienti gli inibitori provocano un aumento della diversità microbica intestinale.

I cambiamenti tassonomici a livello-famiglia rivelano che l’espansione dei Proteobacteria osservata in seguito a terapia con irinotecan deriva da Enterobacteriaceae, e nello specifico Salmonella, Escherichia, Shigella, Klebsiella e Yersinia.

Questi agenti patogeni opportunistici possono riaffiorare da siti di infiammazione di danni epiteliali che fanno fuoriuscire ossigeno nel lume intestinale. Gli Enterobacteriaceae rappresenta l’unico gruppo tassonomico intestinale in grado di esprimere l’operone GUS che contiene al suo interno il gene gus così come il gene dei trasportatori della glucuronide.

E questo permette loro di utilizzare l’acido glucuronico come fonte per crescere. Notare che solo gli Enterobacteriaceae esprimono gli enzimi GUS L1, e cioè quelli che processano l’SN38-G più efficientemente e che sono più fortemente limitati dagli inibitori GUS.

L’inibizione degli enzimi GUS non altera il microbiota intestinale

Gli autori infine hanno esaminato gli effetti dell’irinotecan e degli inibitori degli enzimi GUS sulla composizione del microbiota intestinale nei topi GEMM: essi hanno scoperto che l’irinotecan è il solo driver di cambiamenti nel microbiota e che gli effetti degli inibitori sul microbiota del tratto GI rivelano effetti differenziali in maniera dipendente dalle funzioni immunitarie del modello animale usato.

Questo studio ha stabilito che la tossicità dell’irinotecan può essere alleviata da composti non nocivi che inibiscono l’enzima GUS batterico senza influenzare l’ortologo del mammifero, o la concentrazione di farmaco nel sangue o dei suoi metaboliti.

I composti intestinali dei topi trattati con irinotecan mostrano un’intensa attività di idrolisi di SN38-G rispetto al controllo e ai topi trattati con soli inibitori, suggerendo quindi un aumento di batteri esprimenti enzimi GUS o comunque una up-regolazione in singoli membri del microbiota, in risposta ai trattamenti con l’antitumorale.

Gli autori affermano che comunque il loro studio presenta alcuni limiti:

– la mancanza di modelli animali di tumore al colon

– mancata espansione degli esperimenti in fimo a campioni umani

– mancata ricerca di potenziali implicazioni in disordini intestinali che limitino i livelli di Enterobacteriaceae nel tratto GI.

Conclusioni

In conclusione, l’inibizione mirata di specifiche attività enzimatiche microbiche nell’intestino può migliorare l’esito di trattamenti con chemioterapici, proteggendo l’epitelio intestinale dalla disbiosi microbica e dai danni alla proliferazione.