Uno studio, pubblicato su Natural Structural & Molecular Biology, introduce DQGlyco, un nuovo strumento che apre le porte a una migliore comprensione della complessità della glicosilazione. DQGlyco ha permesso di identificare più di 177.000 N-glicopeptidi unici, consentendo una quantificazione precisa delle variazioni dei glicopeptidi e mettendo in luce come il microbioma intestinale possa influenzare la funzione delle proteine cerebrali.
La glicosilazione proteica si verifica quando le molecole di zucchero si legano agli aminoacidi. Questo meccanismo influenza processi biologici chiave come la segnalazione cellulare, l’adesione e l’endocitosi.
Con oltre 200 enzimi coinvolti, le varianti basate sulla composizione e sulla struttura dei glicani sono numerose, ma errori nel processo di glicosilazione possono influire sulle funzioni delle proteine. Gli strumenti finora disponibili non consentono però un monitoraggio preciso della glicosilazione in quanto mancano strategie di arricchimento altamente selettive e approcci quantitativi ad alto rendimento .
Per soddisfare questa esigenza, i ricercatori hanno sviluppato il cosiddetto Deep quantitative glycoprofiling (DQGlyco), uno strumento che consente di studiare le dinamiche della glicosilazione in cellule umane trattate con un inibitore della fucosilazione e nel cervello di topi colonizzati con determinati microbiomi intestinali. Sebbene sia noto che la composizione del microbioma intestinale influisca sul comportamento e sulla fisiologia cerebrale, i meccanismi molecolari alla base di questo processo sono ancora poco chiari.
DQGlyco ha consentito la preparazione ad alto rendimento di centinaia di campioni al giorno, con una selettività di arricchimento superiore al 90% per tutti i campioni.
Analisi approfondita del glicoproteoma nel cervello di topo
Utlizzando DQGlyco su un sistema più complesso, come il cervello di topo, è stata ottenuta un’analisi approfondita del glicoproteoma.
N-glicosilazione:
- DQGlyco ha identificato 177.198 N-glicopeptidi unici e 8.245 N-glicositi su 3.741 N-glicoproteine, migliorando di 25 volte i risultati ottenuti rispetto ai precedenti studi di N-glicoproteomica.
- La maggior parte delle glicoforme identificate si trovava sulla membrana plasmatica o su proteine extracellulari.
- Sono state identificate 332 nuove glicoproteine, evidenziando la sensibilità del metodo.
- L’identificazione degli N-glicani è risultata in linea con diverse strategie di arricchimento, suggerendo un basso bias di arricchimento verso glicopeptidi specifici.
O-glicosilazione:
- DQGlyco ha identificato 32.287 O-glicopeptidi su 3.450 O-glicoproteine in campioni di cervello di topo, dimostrando un’ampia caratterizzazione della O-glicosilazione intatta nel tessuto dei mammiferi.
- Sono state identificate oltre 494 composizioni uniche di O-glicani, che mostrano diversità strutturale. Le proteine intracellulari sono state modificate prevalentemente dalla N-acetilglucosamina (GlcNAc), mentre gli N-glicani sono stati modificati prevalentemente dalla GlcNAc, suggerendo meccanismi regolatori distinti per la N- e la O-glicosilazione.
Eterogeneità della glicosilazione
Concentrandosi sull’eterogeneità della glicosilazione, diversi siti sulla stessa proteina hanno mostrato una variazione sostanziale nella microeterogeneità, maggiore rispetto all’intero glicoproteoma:
- La diversità è sito-specifica, con una media di 17,4 glicoformi per sito.
- Non è stata riscontrata alcuna correlazione tra il numero di glicositi per proteina o di glicoformi per sito e l’abbondanza della rispettiva proteina.
- Quasi la metà dei siti modificati da una sola glicoforma è caratterizzata da un elevato contenuto di mannosio, il che implica che questi siti siano soggetti a un basso numero di eventi di processamento.
- La distribuzione delle classi di N-glicosilazione variava tra le linee cellulari umane e il cervello di topo, suggerendo differenze nella regolazione dei processi di glicosilazione.
- O-glicosilazione e fosforilazione spesso coesistono nelle stesse regioni proteiche, con conseguente interferenza nelle modificazioni post-traduzionali.
- Circa il 25% dei peptidi O-glicosilati era stato precedentemente segnalato come fosforilato, indipendentemente dalla massa e dalla composizione del glicano.
- Il modello ha discriminato tra siti a bassa e alta microeterogeneità.
- I glicositi extracellulari hanno mostrato una maggiore microeterogeneità dei glicani rispetto alle loro controparti citoplasmatiche sulle stesse proteine, suggerendo differenze subcellulari.
Distribuzione delle glicoforme in cellule e tessuti
La complessità dei pathway di glicosilazione rende praticamente impossibile prevedere la composizione dei glicani maturi. Glicoforme di qualsiasi composizione o struttura potrebbero essere infatti potenzialmente esposte sulla superficie delle cellule.
In questo studio, i ricercatori hanno identificato 3.990 glicopeptidi in 826 siti e 513 proteine in cellule umane viventi intatte HEK293, mostrando variazioni significative nell’abbondanza a seconda delll’enzima.
Le glicoforme ad alto contenuto di mannosio erano generalmente meno esposte in superficie, a differenza della maggior parte delle glicoforme fucosilate o sialilate.
I siti con almeno due glicoforme ad alto contenuto di mannosio esposte in superficie erano generalmente meno accessibili.
Questa eterogeneità si riflette a livello tissutale? Sembra proprio di sì. In effetti, il cervello, il fegato e i reni dei topi mostravano glicoproteomi distinti, pur mantenendo un’elevata coerenza all’interno dello stesso tessuto. In particolare:
- il glicoproteoma epatico ha mostrato la più elevata variabilità nei topi
- i siti di glicosilazione con elevata specificità tissutale erano significativamente arricchiti nei domini proteici cruciali per l’adesione e la segnalazione cellulare e l’immunità.
Concentrandosi sul cervello, è stata eseguita una glicoproteomica quantitativa per determinare le proprietà biofisiche di oltre 30.000 glicoforme. Dai dati ottenuti è emerso che:
- le glicoforme ad alto contenuto di mannosio erano più solubili dei glicani processati, in particolare della proteina caderina-13, forse a causa delle interazioni con la matrice extracellulare
- diverse glicoforme nello stesso sito variano in solubilità, indicando che la microeterogeneità della glicosilazione influisce sugli stati proteici
- la maggior parte delle glicosilazioni tende a influenzare la solubilità delle proteine nella stessa direzione.
Il microbioma intestinale modula il glicoproteoma cerebrale del topo
La composizione del microbiota intestinale può influenzare lo sviluppo e la funzione cerebrale attraverso l’asse intestino-cervello utilizzando la segnalazione nervosa o chimica. Pertanto, i ricercatori hanno valutato l’impatto di diverse composizioni del microbiota intestinale sul proteoma e sul glicocoproteoma cerebrali, riscontrando cambiamenti significativi nell’abbondanza proteica e nei livelli di glicoforme in tre gruppi di sei topi adulti germ-free.
Inoltre, il thermal proteome profiling ha permesso di comprendere l’impatto della colonizzazione intestinale sul proteoma cerebrale dei topi adulti. Molte proteine coinvolte nella guida assonale e nella migrazione neuronale hanno mostrato cambiamenti nella glicosilazione e nella stabilità termica dopo la colonizzazione del microbiota rispetto ai modelli germ-free.
Conclusioni
Questo studio evidenzia un legame significativo tra la microeterogeneità della glicosilazione a livello del sito e gli stati proteici nei tessuti murini e nelle linee cellulari umane. Grazie a una strategia innovativa, denominata DQGlyco, è stato possibile ottenere analisi quantitative e complete delle glicoforme proteiche su un ampio numero e varietà di campioni.
La scoperta di glicositi tessuto-specifici apre la strada all’esplorazione del ruolo della glicosilazione nella modulazione dell’attività proteica in diversi tessuti. Lo studio supporta inoltre l’impatto del microbioma intestinale sulla glicosilazione cerebrale e il potenziale delle modulazioni sito-specifiche nella glicosilazione.
