Ceppi batterici commensali che producono specifici enzimi (acido isoallo-litocolico, 5alpha-reduttasi ecc.) coinvolti nella biosintesi di acidi biliari sono presenti in abbondanza nel microbiota intestinale dei centenari. Potrebbero essere loro a conferire una maggiore resistenza alle infezioni e a garantire l’omeostasi intestinale che li caratterizza. 

Lo concludono Yuko Sato e colleghi della Keio University School of Medicine di Tokyo (Giappone), in uno studio di recente pubblicato su Nature. 

Microbioma intestinale e invecchiamento

È noto il ruolo del microbioma intestinale nel processo di invecchiamento: partecipa attivamente a funzionalità digestiva, mantenimento della densità ossea, dell’attività neuronale e al processo immunitario. Confrontando il profilo microbico di centenari con soggetti più giovani sono state infatti viste peculiarità con, ad esempio, una maggiore inter-variabilità e ridotta diversità. 

La minore suscettibilità a patologie età correlate sembrerebbe poi (in parte) essere correlata a queste loro specifiche caratteristiche batteriche viste più come un fattore causale che una conseguenza della loro età.

Ma quali sono i ceppi responsabili? Scoprirlo è stato lo scopo di questo articolato studio qui riassunto nei suoi passaggi e risultati principali. 

I ricercatori hanno coinvolto un gruppo di centenari (n=106, età media di 107 anni), anziani (85-89 anni, n=112) e giovani (21-55 anni, n=47) per confrontarne e approfondirne le caratteristiche una volta raccolte informazioni sui possibili fattori confondenti quali stile di vita e parametri clinici utili allo scopo (proteina C-reattiva per infiammazione ecc.). 

Da una prima analisi di campioni fecali si è visto come, nei centenari:

• la composizione del microbiota varia significativamente dai due restanti gruppi (i controlli in questo caso)
• a livello di phylum, Proteobacteria e Synergistetes hanno registrato un notevole arricchimento, seguiti da Verrucomicrobia. Depleti invece Actinobacteria. Un’espansione di Proteobacteria è di solito comune in soggetti con patologie infiammatoria intestinale (IBD). A differenza di questi ultimi però, nei centenari l’alpha diversity si mantiene elevata anche rispetto ai controlli
• numerosi sono i taxa ad essere over-espressi rispetto ai controlli suddivisi in i) taxa aumentanti progressivamente con l’età, ii) con abbondanza simile tra giovani e centenari e (la maggior parte) iii) specifici per i centenari quali ad esempio Alistipes, Parabacteroides, Bacteroides, Clostridium, e Methanobrevibacter
• Clostridium scindens è risultata essere una delle specie più arricchite nei centenari. Nota è la sua rara capacità di convertire gli acidi biliari primari in secondari grazie alla produzione di 7alfa-deidrossilasi. Di contro, produttori di butirrato quali Faecalibacterium prausnitzii ed Eubacterium rectale sono risultati assenti in linea con precedenti evidenze osservate in un gruppo di centenari sardi
• meno accentuato, ma presente anche un aumento dell’espressione di Alistipes putredinis e Odoribacter splanchnicus probabilmente da ricondurre a fattori genetici, di stile di vita e dieta

Profilo metabolico intestinale dei centenari

I ricercatori hanno quindi analizzato il profilo metabolico e funzionale fecale in quanto fortemente associato alla componente batterica osservando che nei centenari:

• i livelli di acidi grassi a catena corta  (SCFAs) come acido propionico e butirrico hanno mostrato un decremento con un parallelo aumento di quelli ramificati quali isobutirrico e isovalerico. Tale andamento potrebbe essere da correlare a una parallela diminuzione di ceppi producenti SCFAs e un arricchimento di quelli coinvolti nella fermentazione delle proteine come A. putredinis
• aumento dell’abbondanza relativa di geni coinvolti nella biosintesi di acidi biliari
• aumento del pH fecale spiegabile con la diminuzione di SCFAs e dei succhi gastrici tipici dell’età avanzata. Associazione del pH anche con l’espressione di acidi biliari 
• nonostante il carico totale di acidi biliari non si differenzi significativamente dai controlli, i centenari hanno mostrato una significativa diminuzione di acidi biliari primari e del metabolita dell’acido chenodeossicolico. Di contro, maggiore presenza di varie isoforme di acido litocolico (3-oxoLCA, alloLCA, 3-oxoalloLCA, and isoalloLCA)

Microbiota e acidi biliari

Focalizzandosi sugli acidi biliari si è andato a identificare in vitro i ceppi e gli enzimi responsabili della loro sintesi unicamente espressi nei centenari dimostrando che:

• 20 ceppi di Bacteroidales sono risultati in grado di trasformare 3-oxo-Δ4-LCA in 3-oxoalloLCA, 8 dei quali di produrre anche isoalloLCA
• incubando a pH 9 (fisiologico nell’ambiente intestinale dei centenari) si è osservato un aumento nell’accumulo di 3-oxoalloLCA, isoalloLCA, isoLCA, e 3-oxoLCA rispetto a ph 7, suggerendo come un ambiente alcalino potesse promuovere l’attività o espressione di enzimi coinvolti nella sintesi di acidi biliari
• tra gli enzimi, 5alfa-reduttasi (5AR) e 3β-idrossisteroido deidrogenasi (3βHSDH) sono risultati essere i mediatori della trasformazione di 3-oxo-Δ4-LCA in isoalloLCA

Gli acidi biliari secondari hanno poi dimostrato di giocare un ruolo importante in svariati contesti biologici inclusa la modulazione della risposta metabolica e immunitaria aiutando nella prevenzione dell’espansione di patogeni intestinali. Anche in questo caso:

• isoalloLCA ha potentemente inibito la crescita di C. difficile 630 in vitro a minime concentrazioni. L’attività battericida è stata verificata con microscopia elettronica dimostrando come induca alterazioni morfologiche nel patogeno simili a quanto indotto dagli antibiotici beta-lattamici. Buona attività anche contro C. difficile VPI10463, E. faecium (VRE) resistente a vancomicina e tutti i gram positivi testati 
• 3-oxo-Δ4-LCA, analogamente a isoalloLCA, ha contrastato la crescita di C. difficile e VRE in vitro
• isoalloLCA ha confermato l’attività battericida contro C. difficile 630 anche in vivo senza dare tossicità rinforzata dal co-supplemento della famiglia producente Odoribacteraceae

Seguendo quindi isoalloLCA, in quanto il più promettente tra gli acidi biliari, se ne è valutato l’impatto sui restanti ceppi commensali selezionandone prima 42 e successivamente testandolo sull’intera flora batterica mediate co-incubazione.

• nessun effetto marcato si è osservato nella crescita dei gram negativi quali Bacteroides con, di contro, una notevole interferenza per quella dei gram positivi “buoni” a concentrazioni, tuttavia, più elevate di quanto necessario per i patogeni
• modificando l’ambiente di coltura si è osservata una maggiore resistenza a isoalloLCA dei ceppi commensali, effetto non registrato invece con i patogeni
• co-incubando isoalloLCA con microbiota fecale da donatori sani, si è visto un significativo decremento di gram-positivi come Faecalibacterium, Bifidobacterium, e Streptococcus con, di contro, un aumento di quelli negativi quali Bacteroides e Alistipes in linea con il profilo registrato nei centenari in condizioni fisiologiche. Confermata inoltre l’attività contro C. difficile

Da ultimo, i ricercatori hanno associato la struttura del microbioma intestinale con il profilo degli acidi biliari investigandone la metagenomica.

• tre (V1, V2, V3) sono i cluster genici per 5AR e 3βHSDH identificati in 35 specie (tutte Bacteroidales). V1 li contiene entrambi con in aggiunta l’isoforma 3βHSDH-II ed è stato riscontrato nel genoma di Odoribacter; V2 comprende 5AR e 3βHSDH-I ed è espresso da diverse specie di Bacteroidetes; V3 contiene invece 5AR e 3βHSDH-II nel genoma di Alistipes
• i cluster V1 e V3 hanno poi mostrato associazione significativa con i livelli di isoalloLCA, 3-oxoalloLCA, alloLCA, 3-oxoLCA, e isoLCA oltre che una maggiore espressione nei centenari. V2 ha invece registrato associazione negativa con questi acidi biliari suggerendo l’importanza della co-espressione di 5AR e 3βHSDH-II (non di 3βHSDH-I) per la produzione di isoalloLCA e i restanti acidi biliari
• la produzione di isoalloLCA potrebbe però essere correlata anche a ceppi diversi. Infatti, Anaerotruncus spp. e M. smithii, non codificanti per 5AR, hanno comunque mostrato associazione positiva 
• ceppi inclusi in V3 e, in minor misura, V1 sono risultati maggiormente espressi nel gruppo di centenari, V2 nei giovani
• sia il profilo degli acidi biliari sia quello di composizione batterica dei centenari ha mostrato di essere più stabile nel tempo. 

Conclusioni

Riassumendo quindi, la struttura del microbiota intestinale influenza il profilo degli acidi biliari e comunità batteriche qui denominate di tipo 1 e 3, particolarmente espresse nei centenari, che potrebbero essere promotrici di un ambiente favorevole per l’espansione di ceppi producenti isoalloLCA dalle attività battericide. 

Attenzione posta dagli stessi autori però ai fattori confondenti e alla necessità di validare questi risultati con studi longitudinali in vivo e clinici ad hoc.