Le sostanze perfluoroalchiliche e polifluoroalchiliche (PFAS), un gruppo di migliaia di sostanze chimiche artificiali, concorrono da sole a una spesa sanitaria annua tra 50 e 80 miliardi di euro in tutta Europa. Sono note come “sostanze chimiche eterne” (in inglese forever chemicals) per la loro persistenza nell’ambiente e non solo: sono state trovate nelle pentole antiaderenti, nell’acqua che beviamo e perfino nel nostro sangue. Cosa succede quando entrano nell’organismo? E come reagisce il nostro microbiota?
È la domanda alla base della ricerca di un team dell’Università di Cambridge, UK, guidato da Anna E. Lindell e colleghi, che ha scoperto che alcuni ceppi intestinali possono accumulare i PFAS e favorirne l’espulsione fecale nei topi, riducendone il carico fino al 75%. Tra i più efficaci B. uniformis, con una capacità del 60% per PFAS a catena lunga come l’acido perfluorodecanoico o PFDA. Il team ha testato una miscela di 14 PFAS contenente composti ad alta tossicità come PFNA, PFOA, PFOS, PFDA e PFUnDA. A basse concentrazioni, B. uniformis ed E. coli depleto del gene TolC hanno bioaccumulato quasi il 100% dei PFAS con catena superiore a 10C. Lo studio è uscito a luglio su Nature Microbiology.
Microbiota e capacità di bioaccumulo
I ricercatori hanno valutato la capacità di due comunità sintetiche – ciascuna composta da 10 ceppi intestinali umani – di sequestrare 42 tra i PFAS più comuni in pesticidi, prodotti chimici industriali, cibo e materiali a contatto con gli alimenti, durante 4 ore di esposizione. Entrambi i gruppi hanno ridotto la concentrazione di circa 13 sostanze di oltre il 20%, testate in seguito per la deplezione da parte di 14 ceppi. Nell’arco di 24 ore nove specie batteriche (Bacteroides caccae, Bacteroides clarus, Bacteroides dorei, Bacteroides stercoris, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Odoribacter splanchnicus, Parabacteroides distasonis e Parabacteroides merdae) hanno sequestrato PFOA e PFNA. Il grado di bioaccumulo per l’esposizione a 20 μM di PFNA variava dal 25% (P. distasonis) al 74% (O. splanchnicus) e per 20 μM di PFOA dal 23% (P. merdae) al 58% (O. splanchnicus).
B. uniformis rimuove PFNA a valori simili a quelli riscontrati nelle acque di UE e USA
In aggiunta ai 14 ceppi, i ricercatori ne hanno testati altri 75 implicati nel bioaccumulo di PFNA. La miscela era composta da 66 microrganismi intestinali umani (circa il 70% della flora batterica), 10 probiotici, 10 batteri e 3 lieviti isolati dal kefir. Oltre un terzo dei ceppi, per lo più Gram negativi, ha mostrato una forte capacità di bioaccumulo, probabilmente grazie al maggior contenuto lipidico, con Bacteroidota in testa. Meno efficaci i Gram positivi. Tuttavia, i test su tre specie di lievito (Rhodotorula mucilaginosa, Candida californica e Kluyveromyces marxianus) ad alto contenuto lipidico hanno riportato una capacità di sequestro inferiore al 5%. I ricercatori hanno allora selezionato B. uniformis, un batterio intestinale ad alto accumulo, osservando una capacità intorno al 50% su un ampio intervallo di concentrazioni (da 0,01 a 500 μM) nelle colture sia in crescita sia a riposo. Maggiore era la lunghezza della catena PFAS, maggiore era l’efficacia: dallo 0% per il PFHpA (lungo 7 atomi di carbonio) al 60% nel caso del PFDA (10C). Anche a livelli di esposizione molto bassi, ovvero a 0,34 nM di PFNA – le concentrazioni osservate nelle acque in Europa e negli Stati Uniti – B. uniformis ha riportato un bioaccumulo del 37%, con una concentrazione intracellulare di 50 volte superiore. In condizioni di esposizione a miscele di 14 PFAS, ciascuna a una concentrazione di 1 mg/l (2 μM), il bioaccumulo è risultato additivo tra molecole, con effetti di miscela minimi. B. uniformis, insieme a E. coli depleto del gene TolC, hanno bioaccumulato quasi il 100% dei PFAS con lunghezza della catena superiore a 10C.
Meccanismo di bioaccumulo in E. coli
Nei test sulle cellule a riposo, sia vive sia inattivate, B. uniformis e O. splanchnicus hanno bioaccumulato PFOA, PFNA e PFDA in misura simile (rispettivamente di circa il 20%, il 55% e l’85%). Al contrario, in E. coli in vivo, l’efficacia era inferiore alla metà. Tuttavia, le cellule inattivate hanno bioaccumulato in misura simile a B. uniformis e O. splanchnicus. Ed è qui che i ricercatori hanno ipotizzato che non è la sola adesione ai doppi strati lipidici di membrana a promuovere il sequestro di PFAS e hanno testato due varianti di E. coli (BW25113 e C43) privi di uno o più geni che codificano per le proteine della pompa di efflusso (acrA-acrB e TolC) – meccanismo batterico per ridurre la concentrazione intracellulare di composti tossici – o con permeabilità alterata (imp4213). I ceppi privi del gene TolC hanno mostrato un aumento significativo pari a circa 1,5 volte per il PFDA e a ben 5 volte per il PFNA.
Interazione con il contenuto citosolico
L’imaging FIB-SIMS (criogenic focused ion beam secondary mass spectrometry time-of-flight) ha rivelato una forte presenza di fluoro all’interno delle cellule di E. coli deplete del gene TolC esposte a 250 µM di PFNA, corrispondente al bioaccumulo intracellulare. Le cellule di controllo, al contrario, non hanno mostrato alcun segnale di fluoro. Analisi proteomiche hanno evidenziato in seguito cambiamenti nelle pompe di efflusso in B. uniformis, con un’alterazione del rilascio di chinurenina – metabolita implicato nell’asse intestino-cervello – e di diversi aminoacidi (aspartato, glutammato e glutammina). E. coli, invece, presentava dieci volte di più proteine interagenti con il PFNA. Difatti, nell’arco di 20 giorni i ricercatori hanno osservato un aumento della crescita compreso tra 1,3 e 46 volte per B. uniformis, P. merdae ed E. coli in un mezzo ad alta concentrazione di PFAS (500 μM PFHpA, 500 μM PFOA, 250 μM PFNA o 125 μM PFDA). Il sequenziamento genico delle popolazioni evolute di B. uniformis ha identificato 55 varianti legate all’esposizione a PFNA e PFOA, suggerendo un adattamento evolutivo.
I batteri intestinali influenzano l’escrezione fecale di PFNA nei topi
Infine, i ricercatori hanno somministrato il PFNA in topi C57BL/6J colonizzati con 20 ceppi batterici intestinali umani, confrontandoli con controlli privi di germi (germ free). In base al sequenziamento dell’rRNA 16S dal microbiota fecale 17 ceppi su 20 hanno colonizzato i topi e il PFNA non ha avuto alcun effetto sulla flora batterica intestinale. Tuttavia, esperimenti successivi sui topi germ free hanno rivelato che il microbiota contribuisce all’escrezione fecale di PFNA. I topi sono stati colonizzati con una comunità di cinque ceppi ad alto (Bacteroides fragilis, B. tthetaiotaomicron, B. uniformis, Lacrimispora saccharolytica e Phocaeicola vulgatus) o basso accumulo (Akkermansia muciniphila, Collinsella aerofaciens, Enterocloster bolteae, E. coli e Ruminococcus gnavus) di PFNA. Il primo gruppo ha mostrato una colonizzazione circa due volte maggiore rispetto al secondo, caratterizzato da forte escrezione fecale.
Conclusioni
Il bioaccumulo dei PFAS nei batteri intestinali dipende da interazioni con i trasportatori, dal legame alle proteine e dall’autoaggregazione nel citosol. Paradossalmente, i Gram-negativi – solitamente più resistenti a farmaci e xenobiotici – accumulano PFAS in misura maggiore. Inoltre, il bioaccumulo avviene in tempi molto più rapidi rispetto a quanto osservato nei batteri ambientali, dove il processo richiede giorni. Per chiarire i meccanismi di sequestro microbico sarà fondamentale identificare i trasportatori coinvolti e avviare studi di lungo periodo che monitorino esposizione cronica, livelli ematici, escrezione urinaria e fecale e composizione del microbiota.
