Il calcio assunto con la dieta potrebbe migliorare l’attività di molti probiotici 

Uno studio recentemente pubblicato da Huynh et al. sulla rivista Scientific Reports ha fatto luce sui meccanismi di formazione del biofilm mediato dal calcio da parte dei batteri Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 e Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917. 

Gli ioni calcio (Ca²⁺) si sono dimostrati importanti non solo come nutrienti per la crescita batterica, ma anche per la loro capacità di facilitare le interazioni cellula-cellula e, potenzialmente, la colonizzazione del microbiota intestinale per determinate specie batteriche, come L. acidophilus ATCC 4356.

Precedenti studi hanno dimostrato che cambiamenti nei livelli di calcio introdotto con la dieta influenzano la composizione del microbiota intestinale. Inoltre, il calcio sembra promuovere nell’intestino la vitalità dei batteri appartenenti alla famiglia Lactobacillaceae. Tuttavia, questo meccanismo deve ancora essere chiarito.

Per colmare questa lacuna conoscenza, i ricercatori hanno deciso di valutare gli effetti di diverse concentrazioni di Ca²⁺ (0-25 mM) sulla crescita di Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 e Lactiplantibacillus plantarum ATCC 14917 in terreni ricchi di Ca²⁺ (MRS), in terreni minimi (CDM) e in terreni minimi con mucina (mCDM), una proteina essenziale per l’adesione e nota per la sua capacità di legare gli ioni metallici.

Il calcio promuove la crescita di L. Acidophilus e L. Plantarum

I risultati dello studio mostrano che:

• la crescita di entrambe le specie è stata promossa dall’aggiunta di Ca²⁺, risultando maggiore a concentrazioni più basse per L. acidophilus ATCC 4356
• la mucina ha mostrato un impatto minore sulla crescita rispetto al Ca²⁺, indipendentemente dalla quantità. In particolare, L. acidophilus ATCC 4356 ha mostrato una crescita simile in tutte le condizioni e in tutti i terreni. Al contrario,  il calcio induce la crescita di L. plantarum ATCC 14917 nelle colture MRS e, in misura minore, nelle colture CDM, ma non in quelle con mucina
• la mucina sembra agire come una fonte significativa di calcio nel terreno mCDM, consentendo alle cellule di accumulare abbastanza Ca²⁺ da minimizzare l’impatto dei suoi cambiamenti sulla crescita cellulare nel CDM.

Impatto del calcio sulla formazione di biofilm in L. Acidophilus ATCC 4356 e L. Plantarum ATCC 14917

Insieme alla crescita cellulare, i ricercatori hanno valutato anche la formazione di biofilm a diverse concentrazioni di calcio.

Un aumento di ioni Ca²⁺ ha indotto la formazione di biofilm a 24 e 48 ore, con gli effetti più significativi tra 5 e 25 mM nella maggior parte delle colture. Bassi livelli di Ca²⁺ (5-10 mM) hanno promosso la formazione di biofilm di L. plantarum ATCC 14917 in tutte le colture a 24 ore, mentre a 48 ore il livello minimo era a 25 mM. Al contrario, la formazione totale di biofilm di L. acidophilus ATCC 4356 è risultata massima a 25 mM.

A 24 ore, la conta cellulare di L. acidophilus ATCC 4356 era leggermente superiore a 10 e 25 mM di Ca²⁺ rispetto a 0 mM. Al contrario, per L. plantarum ATCC 14917, dopo 24 ore, la vitalità cellulare a 0 mM di Ca²⁺ era più elevata rispetto alle altre condizioni. Dopo 48 ore, i biofilm formati in presenza di 25 mM di Ca²⁺ sono diminuiti significativamente e la vitalità dei biofilm formati con 0 e 10 mM di Ca²⁺ è leggermente diminuita rispetto ai biofilm a 24 ore per L. acidophilus ATCC 4356.

Oltre agli effetti del calcio, è stato studiato l’impatto degli ioni magnesio (0-25 mM) sulla crescita e sulla formazione del biofilm. L’aumento delle concentrazioni non ha mostrato alcun effetto sulla formazione del biofilm di L. acidophilus ATCC 4356, mentre la sua integrazione fino a 1 mM ha migliorato la crescita delle colture MRS e CDM e ha favorito significativamente la crescita delle colture mCDM per entrambe le specie, mostrando una non specificità come per gli ioni calcio.

Effetti del chelante extracellulare sulla crescita e sulla formazione di biofilm nelle Lactobacillaceae

Gli ioni calcio facilitano l’aggregazione e la formazione di biofilm legandosi alle macromolecole presenti sulla superficie cellulare. In particolare, è stato studiato l’effetto dell’EGTA, un chelante sintetico del calcio, sulla formazione di biofilm in presenza e assenza di Ca²⁺ nelle specie di Lactobacillaceae. In particolare, è stato aggiunto EGTA al terreno di coltura per valutare la capacità dei batteri di competere con il chelante per gli ioni Ca²⁺. Dai dati ottenuti è emerso che L. plantarum ATCC 14917 ha un fabbisogno di Ca²⁺ inferiore in terreni con un contenuto limitato di questi ioni e/o può assorbire il calcio necessario per la crescita in modo più efficiente rispetto a L. acidophilus ATCC 4356. Infatti, nonostante le elevate concentrazioni di calcio, l’EGTA non ha indotto la formazione di biofilm di L. acidophilus ATCC 4356, che è stato in grado di recuperare la sua cinetica di crescita in presenza di un eccesso di chelante e a 10 e 25 mM di Ca²⁺. L’EGTA ha avuto un impatto minore su L. plantarum ATCC 14917 rispetto a L. acidophilus ATCC 4356, ma l’aggiunta di EGTA a 10 e 25 mM di Ca²⁺ ha determinato un modesto aumento della massa del biofilm di L. plantarum ATCC 14917.

In assenza di aggiunta di calcio, L. acidophilus ATCC 4356 è comunque cresciuto in presenza di 50 mM di EGTA, ma non con 80 e 100 mM. L’EGTA ha avuto un impatto negativo anche sulla crescita di L. plantarum ATCC 14917, sebbene non sia stata completamente soppressa.

In sintesi, la conta cellulare del biofilm è stata ridotta in tutte le condizioni con l’aggiunta di EGTA, che si è dimostrato più dannoso per la vitalità di L. acidophilus ATCC 4356 e delle cellule del biofilm rispetto a L. plantarum ATCC 14917, probabilmente a causa della riduzione del Ca²⁺ disponibile per interagire con la superficie cellulare di L. acidophilus ATCC 4356.

Analisi microscopica sulla formazione del biofilm di Lactobacillaceae

L’effetto del Ca²⁺ e dell’EGTA sulla formazione del biofilm di Lactobacillaceae è stato valutato tramite microscopia. I risultati sono i seguenti.

Per L. acidophilus ATCC 4356:

• l’aggregazione cellula-cellula è aumentata con concentrazioni più elevate di Ca²⁺
• le cellule sono passate da filamentose senza Ca²⁺ a bacilloidi con 25 mM di Ca²⁺. Questa trasformazione è stata invertita dall’aggiunta di EGTA.

Per L. plantarum ATCC 14917:

• la densità cellulare è risultata bassa a 0 e 25 mM di Ca²⁺, ma è aumentata a 10 mM di Ca²⁺
• l’inclusione del chelante EGTA non ha influenzato l’aggregazione apparente cellula-cellula (0 e 10 mM Ca²⁺) né la densità cellulare (25 mM Ca²⁺).
• nessun cambiamento apparente anche nella morfologia, che rimane sotto forma di bacilloidi in tutte le condizioni.

Affinità di legame del calcio a L. acidophilus ATCC 4356 attraverso la quantificazione del biofilm

Il Ca²⁺ sembra facilitare la formazione del biofilm di L. acidophilus ATCC 4356 attraverso un meccanismo extracellulare. Per caratterizzarlo, è stata quantificata la formazione del biofilm a 48 ore in presenza di concentrazioni crescenti di Ca²⁺. L’affinità di legame del Ca²⁺ per le proteine ​​varia ampiamente, ma tende a essere più forte per le proteine ​​intracellulari citosoliche e più debole per le proteine ​​extracellulari. Sono necessari ulteriori studi per determinare i siti specifici di legame del Ca²⁺ coinvolti nella formazione del biofilm.

Analisi bioinformatica delle proteine ​​extracellulari che legano il calcio nelle Lactobacillaceae

Utilizzando il metodo di analisi Foldseek per l’indagine bioinformatica delle proteine ​​extracellulari che legano il calcio, note o previste, in L. acidophilus e L. plantarum, questo studio ha scoperto che L. acidophilus presenta diverse potenziali proteine ​​di superficie che legano il Ca²⁺ rispetto a L. plantarum. È probabile che queste proteine ​​extracellulari svolgano un ruolo strutturale nella formazione del biofilm indotta da Ca²⁺ osservata in L. acidophilus ATCC 4356.

Conclusioni

Questo studio evidenzia le funzioni distinte e complementari degli ioni calcio nelle specie L. acidophilus ATCC 4356 e L. plantarum ATCC 14917. Infatti, il Ca²⁺ funge da nutriente intracellulare vitale, essenziale per i processi cellulari e le funzioni metaboliche, ma migliora anche le interazioni cellula-cellula, facilitando la comunicazione e la cooperazione tra batteri. Questo doppio ruolo è cruciale per la sopravvivenza e la persistenza delle Lactobacillaceae all’interno del tratto gastrointestinale. Una comprensione più approfondita del ruolo del Ca²⁺ e di altri ioni metallici nei batteri intestinali è quindi essenziale per comprendere come i componenti della dieta modellano il microbiota e, di conseguenza, influiscono sulla salute.