I fusobatteri sono commensali del microbiota orale che possono diffondersi e colonizzare altri tessuti, favorendo la progressione di alcuni tumori come quello del colon-retto e quello della mammella. I primi studi sull’uso di antibiotici specie-specifici basati su acidi peptido nucleici (PNA) contro la proliferazione dei fusobatteri si sono rivelati promettenti, superando i limiti del farmaco tradizionale, che, sebbene efficace, a lungo andare induce problemi gastrointestinali e disbiosi.
Valentina Cosi dell’Helmholtz Centre for Infection Research (HZI) a Würzburg, in Germania, ha guidato una ricerca sull’efficacia degli acidi peptido nucleici (PNA) coniugati a peptidi in grado di penetrare nelle cellule (CPP, cell-penetrating peptide), contro l’mRNA di geni essenziali per la crescita di Fusobacterium nucleatum. Tra questi, un CPP-PNA di controllo non mirato, denominato FUS79, sembra esercitare tale effetto mediante una risposta allo stress di membrana in ceppi come F. nucleatum subsp. nucleatum ATCC 23726 (FNN23), ma non in ceppi resistenti come F. nucleatum subsp. vincentii (FNV).
Identificazione dei peptidi penetranti nelle cellule (CPP) e dei geni target
I PNA, analoghi sintetici del DNA, appartengono alla classe degli oligomeri antisenso (ASO), capaci di sovrapporsi alla regione di inizio della traduzione (TIR) dell’mRNA – l’estremità 5′ – e impedirne l’interazione con il ribosoma, bloccando così la sintesi della proteina bersaglio. Tuttavia, i PNA non possono attraversare l’involucro batterico perciò, di solito, vengono coniugati a peptidi in grado di penetrare nelle cellule (CPP). I ricercatori hanno progettato PNA mirati contro tre geni essenziali per la sopravvivenza e la proliferazione di F. nucleatum – acpP, ftsZ e gyrA – e li hanno coniugati a due CPP – il peptide ricco di arginina (RXR) 4 XB e quello ispirato alla polimixina (KFF) 3 K – che entrano facilmente in FNN23. Per tenere conto degli effetti aspecifici, i PNA sono stati sperimentati insieme ai relativi controlli non-targeting. Nessun PNA si è rivelato efficace, eccetto per un coniugato non-targeting, l’11-mer (RXR) 4 XB (FUS79).
FUS79 blocca la crescita di FNN23 mediante risposta allo stress di membrana
FUS79 ha bloccato completamente la crescita di FNN23. Tale effetto, ad eccezione per F. nucleatum subsp. vincentii ATCC 49256 (FNV), è stato osservato anche in F. nucleatum subsp. animalis 7_1 (FNA), F. nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586 (FNN25), F. nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 (FNP) e F. periodonticum 2_1_31 (FPE).
Le analisi hanno rivelato una forte induzione dei percorsi KEGG associati ai ribosomi, al metabolismo dell’arginina e della prolina, ai sistemi di secrezione batterica, alla sintesi del peptidoglicano e dello scheletro terpenico e alla degradazione dell’RNA. Percorsi di solito collegati alla risposta agli antibiotici e al mantenimento dell’omeostasi di membrana. Al contrario, erano sottoregolati due percorsi associati al sistema della fosfotransferasi e al metabolismo del glutatione, coinvolti nel trasporto dei carboidrati, nella regolazione della trascrizione e della divisione cellulare.
Analisi dell’espressione genica differenziale tra FNN23 e FNV
I ricercatori hanno trattato FNN23 – il ceppo più suscettibile – e FNV – che era resistente – con FUS79 e il corrispondente PNAscr (il peptide 4 XB non coniugato) o acqua come controllo. A 16 ore dall’inizio dell’attività battericida, l’analisi con RNA sequencing ha riportato una downregulation dei trascritti in FNN23, coinvolti principalmente nel metabolismo delle purine, ma non in FNV. La resistenza di FNV potrebbe essere mediata da modifiche del lipopolisaccaride (LPS) che influenzano l’ingresso di CPP e dalla presenza di geni necessari per l’incorporazione di zuccheri – acido sialico, galattopiranosio, galatturonato e colitosio – nel LPS. Un unico gene, dopo 30 minuti dal trattamento con PNAscr, era sovraregolato in FNV ed era hemC – importante per la biosintesi dell’eme. Dopo 16 ore di trattamento, entrambi i CPP-PNA hanno determinato la sottoregolazione di pckA e pdxS, coinvolti rispettivamente nella gluconeogenesi e nella biosintesi di cofattori essenziali.
Confronto tra le modalità d’azione di FUS79 e PNAscr
Infine, i ricercatori hanno analizzato le differenze nelle modalità d’azione tra FUS79 e PNAscr in entrambi i ceppi e hanno scoperto che in FNN23 82 trascritti erano diversamente espressi tra i due PNA. Il trattamento con FUS79 ha sovraregolato il regolone σE – coinvolto nella risposta allo stress e nel mantenimento dell’integrità dell’involucro – solo in FNN23 mentre, in entrambi i ceppi, ha sottoregolato l’RNA della particella di riconoscimento del segnale 4.5S (RNA 4.5S) – coinvolto nella sintesi proteica batterica e nella traduzione delle proteine di membrana e secretorie verso la membrana interna – e, riguardo al regolone σE, l’sRNA FunR7.
Conclusioni
F. nucleatum possiede un gran numero di sRNA regolatori che possono legare e disattivare (o attivare) mRNA specifici, come nel caso dell’sRNA FoxI, che annulla il legame tra mRNA e ribosoma, bloccando la sintesi proteica. FUS79, che è potenzialmente in grado di inibire la crescita dei fusobatteri mimando tale meccanismo, potrebbe essere un possibile candidato per sviluppare antibiotici specie-specifici che non alterano il microbiota. Tuttavia, per una futura applicazione clinica saranno necessari ulteriori studi che ne identifichino la modalità d’azione.
