• Carcinoma uroteliale e microbioma urinario
• Modifiche nell’assetto batterico vescicale
• Il metodo di campionamento conta
• Taxa specifici associati ai washout vescicali
• Taxa specifici associati ai washout vescicali

Stato dell’arte
Il cancro della vescica è il decimo tumore maligno più comune al mondo e il sesto tumore più comune nei maschi. Il dogma che l’urina sia sterile è stato messo in discussione e la disbiosi del microbioma urinario appare collegata a molti disturbi urologici; recentemente le infezioni batteriche e i fattori ambientali hanno attirato l’attenzione per la loro possibile influenza sull’evoluzione maligna del carcinoma della vescica.

Cosa aggiunge questo studio
Da questo studio emerge che in condizioni maligne i batteri “buoni”, come il Ruminococcus, possono diminuire e i batteri “cattivi”, come il Corynebacterium, possono arrivare in vescica, favorendo l’infiammazione e lo stress ossidativo. Altro dato interessante è che l’urina raccolta attraverso l’uso del catetere e il suo washout sembrano essere maggiormente indicativi della rappresentanza della comunità microbica rispetto all’urina del mitto intermedio.

Conclusioni
La vescica è colonizzata da batteri endogeni e modifiche dell’assetto batterico caratterizzano il microbioma dei pazienti con cancro della vescica. Diverse composizioni microbiche possono essere rilevate cambiando la strategia di campionamento (prelievo di urina attraverso il catetere; washout o da mitto intermedio). Questi risultati aprono la strada all’approfondimento di nuove opzioni diagnostiche e terapeutiche basate sulla manipolazione della comunità batterica.

Il cancro della vescica è il decimo tumore maligno più comune al mondo e il sesto tumore più comune nei maschi. Mentre il fumo di tabacco e l’esposizione professionale a coloranti, gomme e sostanze chimiche sono fattori di rischio accertati per i carcinomi uroteliali, recentemente le infezioni batteriche e i fattori ambientali hanno attirato l’attenzione per la loro possibile influenza sull’evoluzione maligna.

Le tecniche di sequenziamento hanno rivelato la presenza di una comunità batterica unica che risiede nel tratto urinario, che è distinta da quella dell’intestino, della pelle e della vagina e che può essere fondamentale per il mantenimento della salute o lo sviluppo della malattia. Infatti, la disbiosi del microbioma urinario è coinvolta nella fisiopatologia urologica benigna. Inoltre, la scoperta di un microbioma urinario tipico pone nuovi interrogativi su possibili correlazioni con lo sviluppo e/o la progressione di patologie maligne.

Tuttavia, i pochi studi che profilavano il microbioma urinario nel cancro della vescica (BC, Bladder Cancer) hanno riportato risultati incoerenti e sono stati eseguiti con urina contaminata con microrganismi dell’uretra e dell’area genitale.

Con l’obiettivo primario di verificare l’esistenza di un microbioma urinario in una coorte di uomini con o senza BC utilizzando l’urina raccolta tramite catetere, e identificare la prevalenza di alcuni batteri in base alla presenza del tumore e al suo stadio, M. Rescigno, B. Oresta e coll. hanno condotto uno studio appena pubblicato su The Journal of Urology. Come obiettivo secondario, è stata confrontata la composizione della comunità batterica rilevata usando l’urina cateterizzata con quella del lavaggio della vescica e dei campioni di urina del mitto intermedio.

Carcinoma uroteliale e microbioma urinario

Sono stati raccolti campioni da partecipanti maschi con BC e controlli non BC di pari età ricoverati all’ospedale Humanitas di Milano. Sono stati inclusi pazienti con BC con prima comparsa o recidive dopo più di 24 mesi dalla prima resezione del tumore. Sono stati ammessi controlli che si erano presentati per il trattamento minimamente invasivo di malattie benigne, come ostruzione della giunzione ureteropelvica o iperplasia prostatica benigna, durante le quali era necessario l’uso del catetere.

I criteri di esclusione includevano età inferiore a 40 anni, uso di cateteri a permanenza, trattamento con antibiotici o agenti immunomodulatori al momento dell’arruolamento o nei 2 mesi precedenti, storia positiva di malattie sessualmente trasmissibili, infiammazione intestinale cronica o infezione urinaria recente (entro 3 mesi prima dell’arruolamento). Per i pazienti con BC è passato almeno 1 mese dalla cistoscopia alla raccolta delle urine.

L’urina è stata raccolta al momento del ricovero in ospedale, in sala operatoria prima dell’intervento chirurgico e della somministrazione di antibiotici – che possono influenzare la composizione del microbiota – attraverso l’utilizzo di un catetere e con successivo washout. Tutti i casi di cancro sono stati confermati istologicamente come carcinomi uroteliali e classificati secondo i criteri dell’OMS 2016. I campioni di urina sono stati immediatamente posti in ghiaccio secco e conservati a – 80°C fino all’elaborazione. I campioni sono stati centrifugati e il DNA è stato estratto e quantificato.

Le differenze nella composizione del microbioma tra i gruppi sono state valutate con l’analisi multivariata permutazionale della varianza (PERMANOVA) negli indici di dissomiglianza della beta diversità.

Il DNA è stato estratto da un totale di 151 urine raccolte tramite catetere (122 BC e 29 controlli). Sono stati esclusi i campioni con bassa qualità/quantità di DNA o per amplificazione negativa e quindi si è proceduto all’analisi di 61 campioni (51 BC e 10 controlli). La percentuale di campioni di sequenza negativi era del 58,2% nel gruppo BC e del 63,5% nel controllo gruppo. Il gruppo BC includeva campioni di pazienti con diversi stadi suddivisi in: tumori pTa non muscolo invasivi di basso grado (pTa LG), pTa/T1 di alto grado (pTa/T1 HG), carcinoma in situ (CIS) e tumori muscolo invasivi T2.

Modifiche nell’assetto batterico vescicale

Il parametro di uniformità, che esprime la distribuzione di ogni taxa, era significativamente più alto nel gruppo BC. Non sono state osservate differenze in OTU (numero di taxa univoci), Chao (una misura della ricchezza di specie basata su OTU) o indici di Shannon e Simpson (che tengono conto sia dell’uniformità sia della ricchezza). Solo pTa LG ha mostrato un aumento negli indici di uniformità. L’analisi della beta diversità, che rappresenta le differenze nella composizione dei taxa tra i diversi gruppi, ha mostrato che il microbioma urinario dei pazienti con BC non è diverso da quello dei controlli. Tra gli stadi patologici non è emersa alcuna differenza significativa nel microbioma, ma elevata eterogeneità nella composizione.

È stata rilevata una disbiosi in BC: a livello di phylum, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes dominano entrambi i gruppi; 18 famiglie appartenenti a questi 4 phyla sono le più abbondanti nelle urine, con Corynebacteriaceae aumentate nelle urine BC ed Enterobacteriaceae nei controlli. A livello di genere è stato scoperto che Veillonella e Corynebacterium erano maggiormente presenti nel microbioma urinario di pazienti con BC rispetto ai controlli.

Al contrario, in BC è stata osservata una diminuzione significativa di Ruminococcus 1 e di un genere non classificato di Enterobacteriaceae. Una maggiore rappresentanza di batteri specifici era associata a diversi stadi patologici: Veillonella era aumentata nei tumori pTa/T1 HG, CIS e T2 rispetto ai controlli e nei tumori pTa LG; Corynebacterium e Staphylococcus sono stati specificamente ritrovati nei tumori HG NMIBC (Non-Muscle-Invasive Bladder Cancer) e pTa LG, rispettivamente; e una diminuzione del Bifidobacterium caratterizzava T2.

Il metodo di campionamento conta

Nella vescica i batteri possono vivere nelle urine o adesi all’urotelio. È stato ipotizzato che le urine del catetere contengano principalmente batteri fluttuanti, mentre i campioni di washout della vescica sarebbero arricchiti con batteri associati all’urotelio, dato lo stress meccanico applicato durante l’irrigazione. La percentuale di campioni con sequenza negativa era del 66,3% nel gruppo BC e più del 90% nel gruppo di controllo.

I taxa più abbondanti nelle urine sono stati trovati anche nei campioni post washout, con una significativa diminuzione dei phyla Actinobacteria e Firmicutes nei washout rispetto alle urine del catetere, comprese le famiglie Lactobacillaceae e Streptococcaceae, a scapito di un’espansione dei Proteobacteria, comprendente Burkholderiaceae. Inoltre, nonostante la bassa abbondanza (meno dell’1%), è stato osservato un aumento significativo di Erysipelotrichaceae composto da Faecalibaculum e Erysipelatoclostridium. Al contrario, i washout hanno mostrato una diminuzione della Veillonella e Streptococcus rispetto alle urine da catetere. Le urine del mitto intermedio e quelle del catetere hanno diverse composizioni batteriche.

Poiché l’urina del mitto intermedio è un metodo di raccolta non invasivo rispetto al cateterismo, sono state raccolti e sequenziati 14 campioni di urine di pazienti con BC e sono risultate significativamente arricchite in Firmicutes e Fusobacteria; è stata osservata inoltre una maggiore rappresentanza di Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium e Fusobacterium. Al contrario, Ruminococcaceae risultava diminuito.

Questo studio ha messo in evidenza  che la composizione del microbioma urinario in urine raccolte tramite catetere è diversa tra uomini con o senza BC. In particolare, sono stati identificati taxa specifici associati a stadi patologici. I tumori NMIBC e T2 di alto grado sono stati caratterizzati da una maggiore abbondanza di Veillonella, il pTa/T1 HG ha mostrato un arricchimento di Corynebacterium e il pTa LG di Staphylococcus, che sono stati indicati come agenti causali nelle infezioni urinarie. Inoltre, ridotto Ruminococcus 1 nei tumori pTa/T1 HG e T2 e ridotto Bifidobacterium specificamente in T2 rispetto ai controlli. Entrambi questi generi sono stati descritti come antinfiammatori e svolgono un ruolo cruciale nell’omeostasi della mucosa. È interessante notare che il confronto tra i tumori LG e HG suggerisce che la variazione progressiva del microbiota urinario va di pari passo con l’aggressività della malattia. In contrasto con i nostri risultati, Bucevic Popovic et al. hanno riportato una diminuzione di Veillonella e Corynebacterium in BC. Tuttavia, nel loro studio sono stati analizzati solo campioni di urine da mitto intermedio.

Taxa specifici associati ai washout vescicali

Nei washout vescicali sono state riscontrate Burkholderiaceae ed Erysipelotrichaceae, suggerendo che taxa specifici possono crescere associati o all’interno di cellule maligne che si liberano dopo l’irrigazione. A sostegno di questa ipotesi, è stato recentemente descritto che Burkholderia aumenta nei campioni di pazienti con cancro della vescica muscolo invasivo. Le Erysipelotrichaceae diminuiscono nei pazienti con adenoma intestinale e questo scatena la proliferazione delle cellule tumorali. Sarebbe interessante capire quali membri di Erysipelotrichaceae sono maggiormente rappresentati in BC.

È importante sottolineare che non sono state isolate quantità di DNA dai washout di controllo, forse perché in condizioni di salute solo pochi batteri sono adesi all’urotelio, l’adesione tra le cellule uroteliali impedisce la dispersione o la vescica di individui sani è per lo più sterile.

Sono state trovate marcate differenze tra le composizioni microbiche delle urine da cateterizzazione e delle urine da mitto intermedio, con la rappresentanza di organismi come Fusobacterium, noto per associarsi alla progressione del cancro del colon-retto, ed Enterococcus, a sostegno dell’idea che la maggior parte dei microbi da mitto intermedio possono riflettere il tratto urinario distale piuttosto che il microbioma vescicale correlato al tumore.

Infatti, confermando studi precedenti, l’urina del mitto intermedio era arricchita con taxa opportunistici come Streptococcus, Corynebacterium ed Enterococcus. Questi dati confermano che utilizzando solo campioni raccolti direttamente dalla vescica tramite cateterismo transuretrale è possibile studiare la popolazione batterica specificamente associata al BC.

Conclusioni

Sulla base dei risultati di questo studio, appare che in condizioni maligne i batteri “buoni”, come il Ruminococcus, possono diminuire e i batteri “cattivi”, come il Corynebacterium, possono arrivare in vescica, favorendo l’infiammazione e lo stress ossidativo. Inoltre, l’oncogenesi può favorire la disgregazione dell’urotelio e favorire l’adesione e la proliferazione di taxa specifici.

Considerando questo scenario, pare che il microbioma urinario e il tumore possano influenzarsi a vicenda.

I dati emersi da questo studio indicano che un aumento dei batteri opportunisti e una diminuzione dei batteri antinfiammatori caratterizzano BC. Inoltre, pare che l‘urina raccolta attraverso l’uso del catetere e il suo washout siano più indicativi della rappresentanza della comunità microbica BC rispetto all’urina del mitto intermedio.

Questo studio non è privo di limitazioni: gli uomini sono a maggior rischio di sviluppare BC; sono stati inclusi solo partecipanti maschi e questa restrizione limita la generalizzabilità dei risultati, ma riduce al minimo i fattori di confusione. È noto che dopo l’uso di antibiotici il microbiota intestinale si ripristini entro 1,5 mesi. Tuttavia, non si sa dopo quanto tempo il microbioma vescicale si “normalizzi” dopo interventi chirurgici e/o trattamenti.

Futuri studi saranno utili per determinare in che modo la chemioterapia intravescicale, il trattamento con bacillo Calmette-Guérin e l’immunoterapia (come è stato fatto nel melanoma, nel carcinoma polmonare non a piccole cellule e renale) influenzano il microbioma urinario e se specifici batteri sono associati alla progressione del cancro o ad una maggiore efficacia del trattamento.

Questi studi implementeranno lo sviluppo di biomarcatori basati sul microbioma urinario che potrebbero essere utilizzati per scopi diagnostici e prognostici. Inoltre, sarebbe molto interessante sviluppare approcci per modificare il microbiota della vescica al fine di proteggere dalla progressione del tumore e ottimizzare la risposta al trattamento.