Le terapie basate sui microbi stanno emergendo come piattaforma per il trattamento di varie malattie, in particolare quelle con eziologie legate all’intestino. 

Grazie alla loro facilità di produzione, somministrazione e capacità naturale di sintetizzare e fornire farmaci biologici complessi, i microrganismi ingegnerizzati hanno un enorme potenziale come alternative convenienti alle tradizionali terapie biologiche. 

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), un batterio probiotico riconosciuto come sicuro, che mostra attività antibatteriche e antinfiammatorie intrinseche, sta guadagnando terreno nel campo della biologia sintetica, in quanto geneticamente trattabile. 

Uno studio ha indagato lo sviluppo della piattaforma  PROT₃EcT, una suite di Escherichia coli commensali ingegnerizzati per secernere proteine direttamente nell’ambiente circostante, e i risultati sono stati pubblicati su Cell Host & Microbe.

Sistemi secretivi di Gram positivi e Gram negativi 

L’ingegneria batterica è una strategia utile per la somministrazione di agenti terapeutici sfruttando i sistemi di secrezione propri del batterio. 

Nel caso di batteri Gram-positivi, vengono riproposti come meccanismi per secernere agenti terapeutici il sistema di secrezione generale nativo (Sec) e il percorso della traslocazione twin-arginina (Tat).  

Ad esempio, Lactococcus, che secerne anticorpi IL-10 o anti-TNF-α singolo dominio (noti anche come nano anticorpi o Nb), ha dimostrato di migliorare l’infiammazione intestinale in modelli animali. Tuttavia, per i batteri Gram-negativi, l’ingegneria di questi sistemi secretivi conservati è limitata, in quanto essi funzionano principalmente per fornire proteine nella componente periplasmatica del loro involucro esterno.

Data la difficoltà di ingegnerizzazione dei sistemi secretivi dei batteri Gram negativi, vengono utilizzate principalmente varianti di Escherichia Coli programmate per la lisi e il rilascio intracellulare, o per il rilascio di proteine con potenziale terapeutico dalla loro superficie esterna tramite fusione con adesine della membrana esterna. 

Numerosi patogeni batterici Gram-negativi utilizzano complessi sistemi di secrezione, compresi i sistemi di secrezione di tipo III (T3SSs), per il trasporto di proteine batteriche denominate effettori direttamente nel citosol delle cellule ospiti. 

Le macchine di secrezione di tipo III (T3SA) completamente assemblate, vengono incorporate all’interno dell’involucro esterno del batterio con una estensione aghiforme che si aggancia e forma pori nella membrana della cellula ospite. 

I T3SA dei Gram-negativi, tra cui Shigella flexneri ed E. coli enteropatogeno, sono funzionali se introdotti in ceppi di laboratorio di E. coli.

La piattaforma PROT₃EcT e sue varianti

La piattaforma terapeutica programmabile, chiamata PROT₃EcT (PRObiotic Type 3 secretion E. coli)  è una suite di Escherichia coli progettato per esprimere T3SA di Shigella, modificato per secernere proteine nei suoi dintorni piuttosto che direttamente nelle cellule eucariotiche. 

PROT₃EcT può essere ingegnerizzato per secernere proteine eterologhe dotate di una sequenza di secrezione di tipo III N-terminale (SS). PROT₃EcT risulta composta da tre elementi genetici:

• operoni che codificano il T3SA modificato
• VirB, il fattore di trascrizione che controlla l’espressione degli operoni
• il carico di secreto terapeutico. 

Sono state sviluppate anche due varianti di PROT₃EcT, ovvero PROT3EcT-3 e PROT3EcT-4, varianti dotate di un sistema di secrezione costitutivamente attivo che viene mantenuto in assenza di selezione antibiotica. Quando tali varianti secernono costitutivamente Nb, mostrano tassi di crescita e profili di colonizzazione equivalenti a EcN nativo.

Potenziale terapeutico di TNF-PROT₃EcT

Per dimostrare il potenziale terapeutico di PROT₃EcT, è stato ingegnerizzato un TNF-PROT₃EcT, una variante che secerne un anti-TNF-α Nb. Ciò che si è voluto dimostrare è che in un modello preclinico di IBD indotta chimicamente, tale variante risulta efficace nel sopprimere lo sviluppo dell’infiammazione quanto un anticorpo monoclonale anti-TNF-α somministrato per via sistemica.  

TNF-PROT₃EcT, a differenza di PROT₃EcT, ha soppresso l’infiammazione in tutto il colon. Questa osservazione suggerisce che bassi livelli di TNF-PROT₃EcT secreti nel colon distale o nel colon discendentesono sufficienti per bloccare lo sviluppo della colite mediata da TNF-α a valle. 

Inoltre il pretrattamento con una sola dose orale di TNF-PROT₃EcT colonizzante ha migliorato significativamente l’infiammazione e la lesione del colon. Queste osservazioni suggeriscono un vantaggio nel trattamento con batteri colonizzatori, in particolare quando si utilizzano varianti che secernono agenti terapeutici.

Adattabilità di PROT₃EcT

Il design modulare di PROT₃EcT è tale da poter essere adattato per secernere carichi terapeutici diversi e per rispondere all’ambiente circostante. 

Ad esempio, alterando le condizioni che inducono l’espressione di VirB, il T3SA di PROT₃EcT potrebbe essere dotato di un “interruttore di accensione” innescato da segnali specifici dell’ambiente infiammatorio intestinale, ad esempio la presenza di specie reattive dell’azoto. In termini di carichi terapeutici, la versatilità di PROT₃EcT è utile per secernere diversi Nbs, inclusi Nbs che inibiscono l’attività delle tossine batteriche (NbStx2), molecole del checkpoint immunitario (NbPD-L1 e NbCTLA-4) e altre proteine eterologhe. Inoltre, modificando la sua via di somministrazione, PROT₃EcT può essere utilizzato anche per la deposizione di molecole terapeutiche non solo a livello del tratto gastrointestinale, ma anche a livello dei tumori solidi. 

Conclusioni

Sebbene gli studi presentati supportino l’ulteriore sviluppo di PROT₃EcT per il trattamento delle malattie infiammatorie intestinali, la sua modularità consente un suo rapido adattamento in una piattaforma terapeutica per una vasta gamma di malattie. 

Tuttavia, prima di testare uno qualsiasi di questi ceppi modificati negli esseri umani, devono essere dotati di mezzi per controllare il biocontenimento. Alcune strategie in fase di sviluppo includono l’incorporazione di kill switch per limitarne la crescita ambientale.