La fermentazione è una forma di conservazione degli alimenti con origini riconducibili all’età neolitica e, nonostante i recenti progressi nella lavorazione degli alimenti, continua a essere ampiamente utilizzata.

È stato dimostrato che diversi alimenti fermentati hanno migliori proprietà nutritive rispetto alle corrispondenti materie prime grazie ai metaboliti prodotti, alla rimozione di allergeni e alla presenza di microbi che hanno il potenziale per conferire benefici aggiuntivi per la salute.

Inoltre, sebbene l’uso di antibiotici, l’igiene e la lavorazione degli alimenti abbiano notevolmente ridotto la trasmissione di malattie infettive, hanno anche ridotto al minimo la nostra esposizione ai microbi e si pensa che abbiano contribuito “all’industrializzazione” del microbioma umano e all’aumento delle malattie croniche ad essa associato.

I progressi nella tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento hanno rivoluzionato lo studio delle popolazioni microbiche, comprese quelle presenti negli alimenti.

Sebbene, fino ad oggi, la stragrande maggioranza degli studi sugli alimenti fermentati abbia utilizzato il sequenziamento degli ampliconi per studiare la composizione batterica e fungina, ci sono stati alcuni studi eccezionali in cui il sequenziamento shotgun è stato utilizzato per ottenere una maggiore comprensione della tassonomia e del potenziale funzionale di specifici alimenti fermentati.

Alimenti fermentati sotto la lente di uno studio irlandese

Proprio utilizzando sequenziamenti metagenomico di nuova generazione (NGS) John Leech e collaboratori, in uno studio  recentemente pubblicato su mSystems hanno voluto esplorare il microbioma di alimenti fermentati artigianalmente, identificando i fattori che guidano la loro composizione microbica e i potenziali benefici funzionali associati a queste popolazioni.

Gli alimenti sono stati campionati quando erano pronti per il consumo. In tutti i casi è stata campionata la parte commestibile della fermentazione.

Il microbiota cambia a seconda del substrato

In questa ricerca è stato studiato il microbioma di 58 campioni di alimenti fermentati (347.841.507 letture totali; con una media di 5.997.267 letture per campione), la maggior parte dei quali rappresentava tre principali tipi di substrato, ovvero latticini (come kefir e formaggio; n=11), salamoia (come i crauti e il kimchi; n=26) e zucchero (come il kombucha e il kefir d’acqua; n=18).

L’analisi di questi dati e di altri metadati associati, ha rivelato che il microbioma di questi alimenti si raggruppava in modo più significativo sulla base del substrato alimentare.

• La tassonomia era la caratteristica maggiormente distintiva dei substrati alimentari.
• Le differenze di substrato erano maggiori a livello di famiglia, ma erano comunque significative per specie, genere e phylum. Per determinare ulteriormente se le differenze tassonomiche a livello di specie si estendessero al livello di ceppo, è stata condotta un’ulteriore analisi delle letture assegnate a Lactococcus lactis, che ha rivelato che i ceppi sono raggruppati filogeneticamente a seconda del substrato alimentare, con campioni dello stesso tipo aventi una cophenetic distance  inferiore rispetto a campioni di tipo diverso. Non c’era raggruppamento dei ceppi di L. lactis secondo nessun altro fattore.
• L’analisi funzionale ha rivelato che il substrato è il fattore che ha avuto l’impatto maggiore sul profilo funzionale degli alimenti.
• Anche il pathwaydei carboidrati differiva notevolmente tra i gruppi di alimenti.
• Delle caratteristiche esaminate, il profilo del gene della batteriocina era l’unica caratteristica che non era statisticamente diversa tra i substrati alimentari.

Altri fattori che modificano il microbioma

Sebbene meno ovvi dal punto di vista del raggruppamento, altri fattori, come la presenza/assenza di uno starter, lo stato solido/liquido e il produttore, erano ulteriori fattori determinanti le differenze del microbioma.

• La presenza o l’assenza di una coltura starter era associata a differenze nella famiglia, specie, carboidrati, genere, livello Superfocus 3 (SF3) e profilo di resistenza antimicrobica (AMR) degli alimenti. (Il software Superfocus assegna la funzione a un metagenoma e riduce le funzioni in 3 livelli di specificità, di cui il livello 3 è il più specifico).
• Lo stato solido/liquido era significativo a tre livelli tassonomici e tutti e quattro i profili funzionali (tre livelli Superfocus e pathwaysdei carboidrati HUMAnN2), ma ancora una volta con una dimensione dell’effetto inferiore rispetto al substrato e allo stato iniziale. Tuttavia, era l’unico fattore associato a differenze significative tra i profili della batteriocina.
• Il produttore specifico degli alimenti si rifletteva nelle funzioni correlate ai carboidrati e nella composizione delle specie, ma il paese di origine non ha influenzato nessuno dei fattori studiati.

Diversità microbica: latticini e altri alimenti

Nel complesso, 476 specie uniche sono state assegnate ai 58 alimenti, delle quali 301 specie diverse sono state rilevate nei cibi in salamoia, 242 negli alimenti zuccherati e 70 nei latticini.

Ciò corrispondeva, rispettivamente, a una media di 11,5, 13,5 e 6,4 specie diverse per campione.

• In linea con questi risultati, le analisi della diversità alfa hanno dimostrato che il microbioma degli alimenti fermentati a base di latte ha una diversità alfa significativamente inferiore rispetto a quelli della salamoia o dei cibi zuccherini, che non differivano in modo significativo l’uno dall’altro.
• Era anche evidente che, come previsto, la diversità alfa degli alimenti fermentati spontaneamente era significativamente più alta di quelli prodotti utilizzando colture starter.
• Tra gli alimenti specifici, una conserva di arance a fermentazione spontanea conteneva il più alto numero di specie (n=67), mentre un campione di tepache, una bevanda a fermentazione spontanea leggermente alcolica proveniente dal Messico, conteneva il numero più basso di specie osservate (n=12).
• La composizione del microbiota dei latticini è più omogenea di quella di altri alimenti fermentati.

Sono stati studiati undici alimenti fermentati di tipo caseario tutti prodotti attraverso l’uso di colture starter per avviare la fermentazione, contribuendo così alla loro ridotta diversità rispetto ad altri alimenti.

Firmicutes (89,2%) e Proteobacteria (7,9%) hanno dominato. L. lactis dominava a livello di specie, corrispondente, in media, al 44,8% ed era presente al 90% in tre dei prodotti caseari, tutti alimenti di tipo kefir. L’altra specie più abbondante è stata Streptococcus thermophilus (16%), seguita da S. infantarius (5,7%), il lievito Kluyveromyces marxianus (3,7%), Escherichia coli (3,5%), Lactococcus raffinolactis (3%) e L. mesenteroides (2,9%).

È da notare che i virus [incluso il profago] costituivano anche una porzione significativa del microbiota dei latticini (7,8%). La composizione del kefir, inclusa quella dell’agousha, una bevanda russa simile al kefir, era coerente con studi precedenti, sebbene siano stati rilevati alcuni taxa non precedentemente associati al kefir, come il Bifidobacterium mongoliense.

Due campioni di kefir erano fermentati con lo stesso chicco di kefir, ma differivano perché uno era prodotto con latte pastorizzato, mentre l’altro con latte crudo. Sebbene in uno solo di questi due campioni fossero presenti numerose specie, solo una, Pseudomonas helleri, presente nel latte pastorizzato, era presente per il 3%.

Il profilo di un campione di wagashi, un formaggio del Benin, ha rivelato per la prima volta che il nocciolo e la scorza avevano una composizione tassonomica simile e includevano S. infantarius, K. marxianus e una preoccupante rappresentanza di Escherichia coli.

Ryazhenka, un prodotto a base di latte cotto fermentato proveniente dalla Russia, è stato arricchito con S. thermophilus (33,2%). Erano presenti anche altre specie, come S. macedonius (2,8%), ma la caratteristica più evidente di questo alimento era il 54% di virus. Kraken era utilizzato per analizzare la componente virale in modo più dettagliato. Il 97% di queste letture è stato assegnato all’ordine Caudovirales e, a sua volta, il 99,9% di questi Caudovirales è stato assegnato come Streptococcus phage, con S. phage DT1 (57%) il più abbondante.

Ruž’a, un formaggio russo, aveva una grande abbondanza relativa di L. lactis (50,1%), seguito da L. mesenteroides (25%) e L. raffinolactis (15,9%).

Un altro campione russo, il rostagroèkport vorožnyj, uno spuntino fermentato simile al quark, era ricco di S. thermophilus (50,5%).

Il labne irlandese era costituito principalmente da S. thermophilus (86%), ma conteneva anche Lacticaseibacillus paracasei (3,2%) e L. casei (2,3%).

I batteri dell’acido lattico dominano nei cibi salati

Gli alimenti tipo salamoia valutati comprendevano 26 alimenti derivati ​​da substrato vegetale fermentati in una soluzione salina. A differenza dei cibi fermentati sia di tipo caseario sia zuccherino, la maggior parte degli alimenti a base di salamoia subisce una fermentazione spontanea e quindi si basa sulla fermentazione di microbi autoctoni. I cibi salati contenevano principalmente batteri, con l’assegnazione di funghi pari al 3,9% dell’abbondanza relativa di phylum.

Archaea rappresenta meno dello 0,5%. Tra gli alimenti di tipo salamoia, Lactobacillus è il genere più abbondante, il 46,8%. Lactiplantibacillus plantarum è la specie più abbondante (9,6%), seguita da L. brevis (7,9%), L. mucosae (4,7%), L. xianfangensis (4,1%) e L. sakei (3%). Leuconostoc mesenteroides (4,7%) e anche Pediococcus parvulus (4,3%) sono presenti in quantità significative. In tutti gli alimenti in salamoia, le Bifidobacteriaceae sono state rilevate per l’1,6%. A livello di specie, lo 0,8% è Bifidobacterium longum e lo 0,01% B. breve.

Crauti, kimchi et al

I sette campioni di crauti e cinque campioni di kimchi analizzati contenevano molti dei generi considerati tipici di questi alimenti, come Lactobacillus, Leuconostoc, il lievito Pichia, Rahnella e il lievito Kazachstania.

Alcune specie più insolite sono state trovate in bassa percentuale, tra cui Perkinsus marinus (0,33%), un patogeno di ostriche, che è stato rilevato in un campione di kimchi di scalogno e probabilmente originato dalla pasta di gamberetti utilizzata nella produzione di questo kimchi.

Altri alimenti fermentati di tipo salamoia sono stati studiati utilizzando questo approccio per la prima volta. Questi includevano cetriolo lacto-fermentato, pomodori verdi fermentati e kvas di barbabietola. Questi alimenti contenevano molti taxa associati alle piante, comprese grandi proporzioni di Pseudomonas, Lactobacillus e Pediococcus. L’amazake di riso integrale contiene B. longum (7,3%). In totale, B. longum è stato rilevato in 4 dei 7 campioni di crauti, 3 dei 5 campioni di kimchi e 9 degli altri 13 campioni di salamoia. Dal punto di vista del potenziale funzionale, si prevedeva che il 18,4% delle funzioni Superfocus livello 1 (SF1) all’interno del microbioma alimentare salamoia fosse correlato al metabolismo dei carboidrati. Quando i percorsi funzionali sono stati studiati a un livello più approfondito, l’utilizzo dello xilosio (0,6%, SF3), la fermentazione (1,4%, SF2) e la risposta allo stress osmotico (1%, SF2) si sono manifestate tra le funzionalità più comuni.

A livello funzionale, il metabolismo dei carboidrati (16,7%) era la via SF1 più abbondante nei latticini fermentati. I risultati di SF2 hanno evidenziato la presenza di geni con omologia a quelli che codificano la resistenza agli antibiotici e la produzione di composti tossici (2,8% delle letture). Molti dei percorsi SF3 più abbondanti nei prodotti caseari avevano funzioni correlate ai fagi.

Negli alimenti zuccherini dominano le Acetobacteraceae

Sono stati valutati 18 alimenti fermentati zuccherini, tra cui frutta fermentata, kombucha e kefir d’acqua. Alcuni di questi, come il kombucha, il kvas e il kefir d’acqua, contenevano grandi quantità di zucchero da tavola aggiunto, mentre i substrati utilizzati per la produzione di arancia fermentata o idromele, avevano livelli naturalmente elevati di zucchero. Inoltre, sebbene questi alimenti fossero tutti “cibi zuccherati”, comprendevano un’ampia varietà di ingredienti grezzi.

Le fermentazioni a base di zucchero contenevano più alta concentrazione di funghi, con il 19,7% di phylum Ascomycota. Come negli altri alimenti, dominano Proteobacteria (48,9%) e Firmicutes (28,2%). I cibi zuccherini contenevano molte specie associate a fermentazioni generatrici di alcol, lieviti Saccharomyces eubayanus (2,7%), Brettanomyces bruxellensis (5,2%), Hanseniaspora valbyensis (9,3%) e la specie batterica Oenococcus oeni (5%). Lactobacillus era il genere più abbondante (25,8%), ma era inferiore a quello trovato per i latticini e i cibi in salamoia. All’interno di questo genere, L. mali (7,6%) e L. plantarum (5,3%) erano le specie più comuni. L’Acetobacter era il successivo genere più abbondante (10,9%) e la sua distribuzione, insieme ad altri Acetobacteraceae, ne costituiva la famiglia più rappresentata (33,3%).

Tra i tipi di alimenti zuccherini specifici, sono stati analizzati 7 campioni di kefir d’acqua e sono stati trovati taxa tipici, tra cui Kluyvera, Gluconobacter, Brettanomyces, Acetobacter e Lactobacillus. Inoltre, in tre dei campioni di kefir d’acqua era presente Ethanoligenens harbinense, una specie trovata nelle acque derivanti dalla produzione di melassa. Sono stati esaminati due campioni di kombucha e un campione di aceto di kombucha. Sono stati identificati microrganismi kombucha tipici. Il microbiota del tepache è stato studiato per la prima volta consequenziamento shotgun. Il tepache conteneva il numero più basso di specie di tutti gli alimenti, costituito principalmente da L. plantarum (85%), Levilactobacillus brevis (4,6%) e Acetobacter syzygii (3,6%). L’idromele, prodotto utilizzando microbi autoctoni presenti nel miele, conteneva quattro diverse specie di lievito Hanseniaspora, tra cui il già citato H. valbyensis.

La funzione SF1 più abbondante trovata negli alimenti zuccherini era il metabolismo dei carboidrati (14,5%). La resistenza agli antibiotici e ai composti tossici (3,8%) e lo stress osmotico (1%) erano le funzioni più comuni di SF2, mentre l’analisi dei percorsi SF3 ha evidenziato la frequenza di diversi percorsi coinvolti nella sintesi di aminoacidi, come la metionina (0,79%) e biosintesi delle purine (0,68%).

Resistoma diverso per tipo di cibo e fermentazione

Una grande variabilità sia nel conteggio per milione di geni antimicrobici (CPM) sia nella classe di resistenza antimicrobica (AMR) era evidente tra i diversi alimenti, con profili AMR significativamente diversi tra substrati e in linea con la presenza/assenza di uno starter.

Il caseario aveva una media di 3.686 CPM per campione, la salamoia 426 CPM e lo zucchero 261 CPM.

Tuttavia, il nucleo e la scorza del wagashi hanno amplificato i risultati del latte e, se questi vengono esclusi, il CPM medio per i latticini scende a 1.947.

La presenza di presunti geni che promuovono la salute differisce notevolmente tra i cibi fermentati, ma supera comunque quella degli alimenti non fermentati. Le batteriocine sono peptidi antimicrobici di sintesi ribosomiale, molti dei quali sono stati ottenuti da alimenti fermentati.

Sono stati studiati campioni di alimenti fermentati, con 55 cluster di geni codificanti la batteriocina assegnati a 54 alimenti. I cluster genici di zoocina A e enterolisina A erano abbondanti in tutti e tre i substrati alimentari fermentati.

I cluster corrispondenti a un’altra sottoclasse di batteriolisina, le proteine ​​simili all’elveticina J, sono stati rilevati più frequentemente nei latticini e negli alimenti a base di zucchero che negli alimenti di tipo salamoia. I cluster di carocina D e colicina A avevano un’elevata abbondanza in salamoia e zucchero, ma non nei latticini. C’era una differenza significativa nella distribuzione delle batteriocine tra tipi di alimenti solidi e liquidi, con cibi liquidi che avevano un’abbondanza relativa maggiore di gruppi di elveticina J, propioncina F-simile e pediocina e cibi solidi che avevano più cluster simili a carnocin CP52 e microsin 24-like. Esaminando le sequenze della pediocina in modo più dettagliato si è rilevata l’omologia con pedA e pedB.

Nuove specie all’orizzonte

L’assemblaggio metagenomico rivela 10 nuove presunte specie. I genomi assemblati con metagenoma (MAG) sono stati in  totale di 443 , con 127 genomi completi per oltre l’80% e con una contaminazione inferiore al 10%.

Traitar è stato utilizzato per prevedere i fenotipi di crescita dei 127 MAG. Gli output sono stati concatenati in uno singolo per ciascun substrato alimentare e hanno fornito risultati intuitivi, come un’elevata correlazione tra l’utilizzo del lattosio e i latticini e un elevato potenziale di ossidazione del glucosio nel microbioma.

La coerenza tra il Traitar e l’output tassonomico è supportata dall’abbondanza di L. lactis nei campioni di latticini e salamoia. Una migliore comprensione della composizione microbica e del potenziale funzionale di questi alimenti fornisce una panoramica delle caratteristiche comuni e di quelle differenti di questi alimenti  e suggerisce i ruoli potenziali delle singole specie, comprese nuove specie e nuovi ceppi.

È importante sottolineare che la risoluzione tassonomica della metagenomica shotgun  consente l’identificazione del microbioma a livello di ceppo, ma facilita anche una valutazione del profilo funzionale, della distribuzione del gene della batteriocina e AMR, la determinazione dei PHAGC (Potentially Health-Associated Gene Clusters), l’assemblaggio dei MAG e la determinazione dei fenotipi previsti.

Conclusioni

Poiché esistono più di 5.000 varietà di alimenti fermentati in tutto il mondo, spesso con più varietà di ciascuno, non è stato possibile studiarli tutti. Per questo motivo, lo studio si è concentrato su un sottoinsieme di alimenti fermentati artigianalmente, che sono facili da produrre in casa, portando a queste conclusioni preliminari:

• il substrato di fermentazione è il motore più forte della composizione e del potenziale funzionale del microbioma degli alimenti fermentati
• il tipo di nutrienti a disposizione dei microbi determina la diversità all’interno di ogni alimento. L’effetto maggiore del substrato è stato riscontrato tra le varie famiglie, con Lactobacillaceae più persistente nei cibi in salamoia, Streptococcaceae nei latticini e Acetobacteraceae negli alimenti a base di zucchero
• i diversi substrati “impongono” requisiti funzionali ai microbi, come la tolleranza allo stress osmotico in entrambi gli alimenti di tipo salamoia e zucchero. Sarebbe interessante in futuro estendere l’analisi ad altri importanti substrati di fermentazione come carne, pesce e cereali
• le analisi riflettono la composizione degli alimenti consumati e non le colture starter utilizzate per produrre questi alimenti o il microbioma intermedio che produce il prodotto finale
• non sorprende che, data la diversità degli alimenti fermentati, il paese di origine non abbia influenzato in modo significativo alcuna delle caratteristiche esaminate. Non è chiaro il motivo per cui i cluster genici della batteriocina differiscano tra cibi solidi e liquidi, ma forse le matrici degli alimenti solidi richiedono strumenti ecologici diversi per un vantaggio competitivo rispetto ai substrati liquidi
• la produzione di batteriocina è una caratteristica dei probiotici; si ritiene che le proteine ​​siano prodotte dai batteri per ottenere un vantaggio competitivo rispetto ad altri taxa, tipicamente quelli che occupano la stessa nicchia ambientale. La produzione di batteriocina può contribuire alla qualità e alla sicurezza degli alimenti attraverso la rimozione del deterioramento e dei batteri patogeni, ma la produzione di batteriocina in situ nell’intestino può anche consentire ai batteri produttori di stabilirsi, competere contro taxa indesiderati e contribuire al dialogo ospite-microbo.

Nel complesso, questo studio ha combinato molte nuove intuizioni sul microbioma degli alimenti fermentati, inclusi molti alimenti che non erano mai stati descritti in precedenza utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NGS).

I genomi, inclusi quelli di taxa potenzialmente nuovi, contribuiranno in futuro a una migliore assegnazione delle letture degli alimenti fermentati e allo sviluppo di studi più ampi sul microbioma della catena alimentare.