Grazie alla presenza di elementi genetici mobili (MGE), i batteri possono aumentare la tolleranza a vari fattori di stress ambientale acquisendo geni accessori. Tra questi, gli elementi genetici extracromosomici (ECE) sono rimasti a lungo inesplorati negli studi metagenomici, che si basano soprattutto su tecnologie di sequenziamento a lettura corta poco efficaci nell’assemblare regioni genomiche complesse. Un’ulteriore criticità è la presenza, nella saliva, dell’85–95% di DNA di origine umana, rendendo difficile recuperare sequenze batteriche di alta qualità.
In uno studio pubblicato su Nature Communications, Yutaka Suzuki e colleghi dell’Università di Tokyo hanno sviluppato un metodo innovativo, che consiste nel trattare il pellet batterico con nucleasi (preNuc), per estrarre DNA ad alto peso molecolare in presenza di DNA umano. L’analisi metagenomica di 56 campioni salivari ha riportato la presenza di grandi elementi di DNA extracromosomici, che gli Autori hanno chiamato “Inocles”, nel microbioma orale del 74% dei partecipanti. Si tratta di molecole genomiche circolari, simili a plasmidi, che sfruttano Streptococcus come batterio ospite e codificano per geni di resistenza allo stress e riparazione del DNA. La loro carenza, osservata in 68 pazienti con tumori testa-collo o colorettali, suggerisce un potenziale uso come biomarcatore.
Gli Inoclesriscrivono la genetica orale
I ricercatori hanno trattato il pellet batterico con nucleasi (preNuc), riuscendo così a estrarre DNA ad alto peso molecolare, riducendo la presenza di DNA umano di circa il 50% nelle sequenze a lettura corta. Sono state ottenute sequenze da 46 campioni di saliva, con una media di 3,2 milioni di letture non umane di alta qualità e un totale di 23,4 Gb per campione. 69.881 sequenze contigue (o contig) – con una similarità superiore al 98% e di lunghezza superiore ai 3 kb – sono state classificate come potenziali cromosomi batterici (oltre l’85%), sconosciute (quasi il 10%), plasmidi (circa il 3%) e fagi (l’1,5%). Da 85 sequenze inedite sono stati ottenuti 19 cluster, con il Cluster 0001 più abbondante, che conteneva 13 nuove sequenze contigue con una dimensione media di 352 kb. La mappatura delle letture a catena lunga ha mostrato un assemblaggio accurato e una copertura uniforme lungo tutte le sequenze, compatibile con una topologia circolare. Il preNuc, in particolare, ha aumentato la copertura del Cluster 0001 di oltre il triplo rispetto all’assemblaggio a letture corte.
InoC: il marcatore che identifica la famiglia Inocle
L’analisi di tutti gli ORF (Open Reading Frame) — tratti di DNA potenzialmente in grado di generare proteine — ha rilevato la presenza di un gene marcatore degli Inocles, chiamato InoC, lungo circa 454 amminoacidi e assente da tutti database esistenti. Il sequenziamento metagenomico dei campioni salivari di individui sani provenienti da Cina, Filippine, Francia, Stati Uniti, Fiji, Giappone e Indonesia ha rilevato la presenza di Inocles in quasi un terzo dei partecipanti, con la prevalenza maggiore negli indonesiani (90%) e quella più bassa nei giapponesi (64%). I ricercatori hanno inoltre identificato 29 sequenze contigue circolari chiuse e potenziali regioni di origine e termine della replicazione, inclusi quattro gruppi distinti: Inocle-α, β, γ e δ. Inocle-α, con il contig più grande (368 kb in media) e ricco di elementi di inserzione, dominava nel 57% dei campioni, sebbene nei paesi non industrializzati di Indonesia, Filippine e Fiji fosse più comune Inocle-β. Sono state identificate 1.619 famiglie proteiche, con un’elevata somiglianza intragruppo – di circa il 95% – ma non intergruppo. L’analisi dei dati dello Human Microbiome Project ha mostrato che l’habitat degli Inocles è la cavità orale, con Inocle-α situato soprattutto sul dorso della lingua, Inocle-β e Inocle-δ a livello della mucosa buccale e Inocle-γ sulle gengive.
Vicini ai plasmidi di Streptococcus, ma con un’identità unica
L’analisi PCR e il sequenziamento del genoma hanno rivelato che le sequenze di tre colonie batteriche su cinque, coltivate in campioni di saliva contenente un esempio di Inocles (Inocle_004), erano di Streptococcus salivarius e presentavano geni omologhi con gli Inocles. Nel confronto con le firme genomiche dei vari MGE di Streptococcus, gli Inocles si avvicinavano ai plasmidi, sebbene avessero una composizione nucleotidica unica: solo 20 ORF (6%) erano geni condivisi con i cromosomi batterici. Gli Inocles esprimevano 21 geni codificanti soprattutto per proteine sconosciute (localizzate subcellularmente) e citoplasmatiche, con la metà delle funzioni associate alla riparazione e alla ricombinazione del DNA – ad esempio, DNA girasi e DNA polimerasi III – e alla risposta allo stress – come RpoS e NrdH. Un’altra parte degli ORF, invece, sembrava associata alla parete cellulare, poiché codificava per la proteina di biosintesi/degradazione del peptidoglicano – espresso in tutti i taxa – e sortasi A, che la ancora al peptidoglicano.
Inocle-α: un possibile ponte tra microbioma e immunità
L’analisi del trascrittoma a singola cellula delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), ottenute da 29 campioni di saliva, ha riportato una forte correlazione tra Inocle-α e cellule B intermedie, della memoria e naïve. Non solo, in base all’analisi genomica di 5.420 proteine plasmatiche da 40 volontari giapponesi sani, chi presentava il gene degli Inocles mostrava un arricchimento di 43 pathway, incluse le vie del recettore delle cellule B e delle risposte alle infezioni batteriche e virali come quella da Escherichia coli o l’epatite B. È stata riscontrata anche una sovraespressione di proteine implicate nell’aterosclerosi, nell’apoptosi e nella segnalazione del TNF e dell’NF-κB. Nonostante ciò, l’associazione tra Inocle-α e alcune forme di cancro, come il tumore testa-collo e il cancro del colon-retto, è risultata debole.
Conclusioni
Questa ricerca apre la strada a una comprensione più ampia dell’impatto degli Inocles sull’adattabilità del microbiota orale e, di conseguenza, sulla salute umana. Secondo gli autori queste strutture potrebbero diventare biomarcatori utili per test non invasivi per diverse forme di tumore, tra cui il tumore testa-collo e il cancro del colon-retto. Tuttavia, saranno necessari studi effettuati in condizioni sperimentali più stabili, in grado di mantenere gli Inocles all’interno delle cellule batteriche ospiti, permettendone l’analisi approfondita delle funzioni — tuttora sconosciute per circa il 95% dei geni — e l’identificazione delle specie ospitanti.
