Rip1, la proteina che buca la membrana batterica per fermare i fagi

Contro i virus che li infettano – i fagi – i batteri hanno sviluppato sofisticati sistemi di difesa, molti dei quali si avvalgono di complessi sistemi di segnalazione e grandi aggregati proteici per funzionare.

Negli eucarioti, il riconoscimento degli agenti infettivi avviene attraverso recettori specializzati in grado di identificare molecole che originano dai patogeni, come acidi nucleici e proteine strutturali, attivando risposte effettrici come la rottura della membrana o la morte cellulare programmata. Secondo un nuovo studio guidato dall’Università di Toronto accade una cosa simile nei batteri.

I ricercatori, guidati da Karen Maxwell e Michael Norris, hanno identificato una nuova proteina batterica chiamata Ring Interacting Pore 1 (Rip1), in grado di riconoscere componenti virali e limitarne la replicazione. La molecola, composta da 164 amminoacidi e codificata dal profago DMS3 di Pseudomonas aeruginosa, è stata rilevata in diversi taxa, tra cui Escherichia coli, Vibrio, Klebsiella/Raoultella, Burkholderia, Salmonella ePseudomonas. L’analisi genomica ha inoltre rivelato che nel 98% dei casi i geni che codificano per Rip1 sono associati a regioni di origine virale, suggerendo una co-evoluzione tra batteri e virus. La scoperta, pubblicata a febbraio su Nature, aggiunge un ulteriore tassello alla comprensione delle strategie di immunità microbica e difesa virale.

Rip1 abbassa il potenziale virale dei fagi

I ricercatori hanno coltivato Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli in condizioni standard, utilizzando ceppi ingegnerizzati esposti a un pannello di fagi. Questo approccio ha permesso di identificare Rip1 all’interno del profago DMS3 di P. aeruginosa, in una regione genomica associata a geni coinvolti nell’assemblaggio virale.

Rip1 ha ridotto drasticamente la capacità infettiva di alcuni fagi, in particolare YA3 e Ab31, con una diminuzione dell’efficienza di semina, indice della capacità infettiva del fago, di oltre 105 volte. Due le strategie principali: infezione abortiva (che porta alla morte della cellula infetta) e immunità diretta (che consente la sopravvivenza dell’ospite). Nel confronto tra ceppi lisogeni selvatici e mutanti privi di Rip1, l’assenza della proteina in questi ultimi inibiva la difesa e portava a morte cellulare. Non solo, le analisi al microscopio hanno mostrato che nei profagi selvatici la lisi iniziava molto prima e comportava l’alterazione della morfologia – dal tipico aspetto a bastoncino a una forma sferica – potenzialmente correlata alla rottura membrana interna.

La sola azione Rip1 non basta a inibire la replicazione virale

I fagi capaci di eludere la difesa fornita da Rip1 presentavano mutazioni ricorrenti nelle proteine del portale – cruciali per l’assemblaggio del virione – simili a quelle presenti in YA3 e Ab31 – e in quelle terminali piccole (ST) dei geni Queste mutazioni sono state individuate proprio nella zona potenziale di interazione tra Rip1_Pae e proteina del portale, il residuo Phe162. Un elemento chiave emerso dall’analisi genomica è il complesso Rip1_Eco-ST. Da sola,  Rip1_Ecotende a formare un dimero, cioè una struttura costituita da due subunità: quando entra in contatto con ST, si organizza in una struttura di dimensioni maggiori, composta da più subunità, creando un grande poro che rompe la membrana..

Il complesso Rip1_Eco–ST danneggia selettivamente la membrana batterica

L’interazione tra Rip1 e ST compromette selettivamente l’integrità delle membrane batteriche attraverso, quindi, la creazione di pori, in maniera analoga a quella di tossine come le gasdermine, e arrestando la divisione cellulare. Le immagini ottenute al microscopio suggeriscono che sia la formazione dell’agglomerato sia la specificità di riconoscimento dei fagi è mediata da un dominio che lega uno ione zinco sulla struttura di Rip1, chiamato zinc ribbon di tipo C4, localizzato nella porzione terminale della proteina. L’unicità di questo meccanismo risiede nel fatto che è sostenuto da una singola proteina, a differenza delle gasdermine, che richiedono un’attivazione proteolitica mediata da sensori specifici. Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che alterazioni nella regione di contatto tra Rip1 e ST, compromettono l’assemblaggio del complesso e, di conseguenza, l’attività difensiva.

Rip1 media la difesa antivirale di diversi taxa

Analisi bioinformatiche hanno infine identificato oltre 4.100 omologhi di Rip1 in batteri Gram-positivi e Gram-negativi, con una lunghezza media di circa 155 aminoacidi. Uno in particolare, Rip1_Vpa, ha mostrato una capacità protettiva da cento a mille volte superiore, con un ruolo protettivo per diversi ceppi. La proteina era presente in E. coli (876 sequenze), Vibrio (254 sequenze), Klebsiella/Raoultella (249 sequenze), Burkholderia (174 sequenze), Salmonella (171 sequenze) e Pseudomonas (148 sequenze). Secondo l’analisi del genoma, nel 98% dei casi questi geni risultano associati a regioni di origine fagica, indicando una probabile co-evoluzione tra batteri e virus. 

Conclusioni

La scoperta apre nuove prospettive per applicazioni biotecnologiche e nel controllo delle infezioni batteriche, anche se saranno necessari ulteriori studi per chiarire i meccanismi di attivazione e la specificità di riconoscimento nei diversi contesti microbici.