• Caratteristiche fisico-tecnologiche
• Processo di validazione
• Conclusioni

Stato dell’arte
Nello studio del microbioma intestinale, i risultati ottenuti dal materiale fecale sono rappresentativi soprattutto della popolazione batterica del colon, meno di quella delle porzioni superiori. Il difficile campionamento limita le conoscenze a riguardo.

Cosa aggiunge questo studio
Scopo dello studio è stato mettere a punto e validare una nuova modalità di campionamento del microbiota intestinale basato sull’ingestione di una pillola micro-ingegnerizzata e biocompatibile.

Conclusioni
La soluzione tecnologica proposta è risultata adatta all’utilizzo in vitro e in vivo. è stato quindi ipotizzato un suo futuro utilizzo nelle procedure diagnostiche e di screening.

Può il microbioma intestinale essere campionato direttamente in loco nella sua interezza e complessità, ingerendo semplicemente una pillola? Sembrerebbe di sì, grazie al lavoro coordinato da H. Rezaei Nejad della Tufts University (USA), di recente pubblicazione su Advanced Intelligent System.

Trarre conclusioni sulla componente batterica intestinale complessiva basandosi solamente sui campioni fecali è alquanto riduttivo, considerando la sua estrema variabilità spaziale e temporale lungo tutto l’apparato. Tuttavia, il campionamento in vivo, soprattutto del tratto iniziale dell’intestino, risulta alquanto complicato per ovvie ragioni. Da qui, la comune scelta dell’analisi fecale, ma al contempo la consapevolezza della necessità di un’alternativa diagnostica in grado di fornire una visione del microbiota più completa, evitando procedure troppo invasive per il paziente.

La “pillola intelligente” proposta dai ricercatori americani in questo studio ha tale scopo. Di seguito le sue principali caratteristiche, nonché i passaggi di messa a punto e validazione.

Caratteristiche fisico-tecnologiche

Dal punto di vista strutturale la pillola, successivamente inclusa in una capsula (tipo 0) per una maggiore protezione in ambiente gastrico, è composta da una testa per la raccolta del campione, una membrana semipermeabile in acetato di cellulosa nel corpo centrale per la filtrazione selettiva dei batteri da includere e un serbatoio inferiore con cloruro di calcio anidro, fonte “energetica” per il flusso osmotico, meccanismo di base per l’intrappolamento dei batteri.

La normale peristalsi intestinale sembrerebbe assicurarne un corretto movimento. L’utilizzo di un magnete esterno (tuttora in fase di messa a punto per i test in vivo) permetterà inoltre un ulteriore controllo della sua posizione con lo scopo, al bisogno, di prolungarne la presenza e quindi il campionamento in corrispondenza di una particolare regione anatomica. Infine, nei test di validazione in vivo, l’aggiunta di marcatori fluorescenti al suo esterno ne hanno consentito un più facile tracciamento una volta espulsa con le feci.

Processo di validazione

Il microbiota intestinale si compone di microrganismi non sempre dotati di una propria autonomia motoria. I test di intrappolamento in vitro per verificare l’efficacia del sistema osmotico sono quindi stati condotti sia in ambiente con particolato solido non abile al movimento sia in presenza di batteri dall’elevata motilità (Bacillus subtilis).

Nel primo caso, le micro-particelle da intrappolare sono state immerse in una soluzione molto viscosa per l’alta concentrazione di PEG, a pH 4 e 8 rispettivamente, in modo da mimare l’ambiente gastrointestinale. Considerando le loro dimensioni, ridotte ma sufficientemente grandi per non essere soggette ai casuali moti Browniani, l’inclusione delle micro-particelle all’interno della capsula sarebbe stata quindi da ricondurre al flusso osmotico. Dal monitoraggio delle tre capsule testate è emerso che:

  • il numero di particelle intrappolate aumenta con il tempo di permanenza nella soluzione, come del resto la concentrazione dell’idrogel nel quale sono immerse
  • a pH 8 il flusso d’entrata si è mostrato più elevato a causa di una maggiore dimensione dei pori della membrana semipermeabile (35mV vs 10 mV)
  • il campionamento ha dato riscontri positivi in entrambe le condizioni di pH nonostante a valori basici sia stato registrato un maggior numero di particelle intrappolate.

Passando poi al test con microrganismi mobili è emerso che:

  • la concentrazione dei batteri all’interno delle pillole ha raggiunto valori pari a quelli esterni dopo un’ora e mezza, di tre volte superiori dopo tre ore
  • dopo 24 ore i batteri intrappolati hanno dimostrato motilità attiva.

Dopo il caricamento del campione, è stata valutata la capacità della pillola di avanzare attraverso l’intestino mediante test ex-vivo.

A un flusso di 4, 8 e 10 mL/min (indicativi di una diversa peristalsi pre- e post-prandiale) la pillola ha dimostrato una velocità di movimento pari a circa 10, 13 e 22 cm/min rispettivamente, registrando quindi una risposta simil-fisiologica con incremento non lineare attribuibile probabilmente alla diversa viscoelasticità dei tratti intestinali.

I ricercatori hanno inoltre condotto ulteriori saggi in vitro e in vivo per approfondire le caratteristiche della formulazione. Tre pillole sono quindi state immerse sequenzialmente in una sospensione di E. coli, B. subtilis e L. rhamnosus (pillola 1) o solo di E. coli e L. rhamnosus (pillola 2 e 3). Dopo 4 o 8 ore è stato quindi quantificato e analizzato il materiale raccolto.

Tutti i ceppi sono stati rinvenuti nelle formulazioni, sebbene L. rhamnosus abbia dimostrato in generale una maggiore concentrazione rispetto alla durata di immersione nell’ambiente di coltura batterica.

È stata in seguito testata l’effettiva necessità della pompa osmotica nel campionamento confrontando il “carico batterico” di formulazioni con e senza il cloruro di calcio nell’opportuno compartimento.

Dopo 12 ore di immersione in materiale fecale, il DNA batterico estratto nelle pillole sprovviste di sistema osmotico funzionante è risultato dalle 2,4 alle 59 volte meno concentrato rispetto alle condizioni standard, confermandone l’essenzialità.

Conclusioni

Mediante la combinazione di altri test in vitro e in vivo condotti principalmente su suini e primati non umani, è stato infine dimostrato come la nuova formulazione tecnologica creata sia in grado di collezionare attivamente campioni indipendentemente dalla natura e/o provenienza dell’ambiente circostante, permettendo inoltre di risalire alla sede di campionamento.

In conclusione, la tecnologia farmaceutica sviluppata in questo studio ha dimostrato la possibilità di un efficiente e tracciabile campionamento batterico nei diversi tratti di intestino in maniera sicura e notevolmente meno invasiva rispetto alle pratiche in uso. Ulteriori perfezionamenti e indagini sono però necessari al fine di una sua implementazione nella pratica clinica corrente.