Stato dell’arte
L’infezione da Clostridium difficile è una delle maggiori cause di diarrea associata ad antibiotici e la compromissione dell’equilibrio batterico intestinale è un fattore predisponente la sua colonizzazione.

Cosa aggiunge questa ricerca
Il Clostridium difficile, producendo l’agente batteriostatico para-cresolo, è in grado di competere con i batteri commensali “buoni”, assicurandosi la sopravvivenza intestinale e determinando la patogenesi diarroica.

Conclusioni
Lo studio offre nuove basi per la ricerca di terapie focalizzate sulla modulazione della produzione di para-cresolo al fine di diminuire la virulenza di Clostridium difficile e i conseguenti effetti per l’ospite.

Il Clostridium difficile, grazie alla peculiare capacità di produrre l’agente batteriostatico para-cresolo mediante fermentazione, è in grado di entrare in competizione con i batteri commensali “buoni”, assicurandosi la sopravvivenza intestinale e andando a determinare la patogenesi diarroica. È quanto dimostra l’ampio studio coordinato da Ian J. Passmore della London School of Hygiene and Tropical Medicine, di recente pubblicato sulla rivista PLOS Pathogens.

Antibiotici, diarrea e infezioni da Clostridium difficile

L’infezione da C. difficile rappresenta una delle maggiori cause di diarrea associata ad antibiotici considerando come la compromissione dell’equilibrio batterico intestinale sia un fattore predisponente la sua colonizzazione.

Nonostante il trapianto di microbiota fecale abbia a oggi dimostrato buoni risultati d’efficacia, è tuttora necessario comprendere meglio come agisce questo patogeno al fine di individuare eventuali terapie alternative a quella in uso.

In questo studio i ricercatori si sono concentrati sulle caratteristiche di attività del C. difficile in vitro e in vivo, analizzando in particolar modo gli effetti del metabolita para-cresolo (p-cresolo). Quest’ultimo ha in precedenza dimostrato proprietà batteriostatiche, inibendo selettivamente la crescita di alcune specie batteriche e di altri microrganismi.

Interessante notare come la produzione di questo composto fenolico, almeno stando alle attuali evidenze, sia una prerogativa solamente di un ristretto numero di organismi, 18 dei quali sono nostri batteri commensali. Trattandosi, come anticipato, di uno studio ampio e complesso, di seguito sono riportati unicamente i risultati principali.

P-cresolo e inibizione dei Gram negativi

È stato ipotizzato che la produzione di p-cresolo conferisca a C. difficile la capacità di ottenere vantaggi in termini di colonizzazione se confrontato con determinate specie.

Per verificare ciò, i ricercatori hanno valutato in vitro gli effetti del p-cresolo esogeno sulla crescita e l’adattamento di commensali selezionati rispetto al ceppo C. difficile 630Δerm e/o hpdC::CT, andando a dimostrare in generale che:

• I batteri Gram positivi sono notevolmente più tolleranti al p-cresolo rispetto ai Gram negativi
• La crescita di Gram negativi, per esempio Bacteroides thetaiotamicron, E. coli, Klebsiella oxytoca e Proteus mirabilis, in presenza di p-cresolo è risultata inibita in maniera dose-dipendente e la crescita cellulare notevolmente ridotta rispetto a C. difficile
• Gram positivi come B. adolescentis, E. faecium o L. fermentum, non hanno presentato una riduzione significativa in termini di crescita anche ad alte dosi di p-cresolo

Vantaggi di crescita competitiva in vitro

Il p-cresolo ha dunque effetti diversi sulla dinamica di crescita in base al phylum e al grado di suscettibilità batterica.

Per valutarlo è stato predisposto un test in vitro volto a comparare la crescita di E. coli e K. Oxycota, in presenza del metabolita, con quella di C. difficile.

Come previsto, C. difficile ha mostrato una crescita esponenzialmente maggiore rispetto alle altre due specie, trend tuttavia non mantenuto, in ulteriori saggi, dalla versione del batterio mutata e perciò non in grado di produrre p-cresolo.

Il p-cresolo è prodotto attraverso la fermentazione della tirosina per azione dell’enzima p-idrossifenilacetato (p-HPA). L’ulteriore aggiunta dello 0.2% (13.1 mM), e successivamente dello 0.3% (19.7 mM), di questo mediatore al medium della co-coltura C. difficile/E. coli ha comportato differenze significative con entrambi i dosaggi nel rapporto tra le due specie rispetto alle condizioni precedenti all’aggiunta.

L’HPLC ha poi ulteriormente confermato come la quota di p-cresolo prodotto sia direttamente dipendente da quella di p-HPA, registrando un aumento di metabolita di circa 25 mM allo 0.3%.

Inoltre, in condizioni di crescita competitiva, circa 4.8 mM di p-HPA sono stati sufficienti nell’ostacolare la crescita di batteri come K. oxycota o B. thetaiotamicron, ma non quella di E. coli che ha quindi presentato maggiore resistenza.

Infezione da C. difficile in modelli murini di ricaduta

Al fine di confermare i dati relativi alla capacità di p-cresolo di favorire la sopravvivenza di C. difficile finora ottenuti in vitro, sono stati condotti ulteriori test su modelli murini C57BL/6 confrontando quelli infettati con il ceppo 630Δerm (n=5) o hpdC::CT mutato (n=5), ai quali è stata poi indotta una ricaduta, con esemplari di controllo (n=5).

Prima della contaminazione con il patogeno, ai modelli è stato somministrato l’antibiotico cefoperazone per indurre disbiosi e, a 28 giorni dall’infezione, vancomicina per favorirne la ricaduta. I livelli di infezione sono stati monitorati attraverso la valutazione della concentrazione di spore fecali di C. difficile.

• Sulla base delle spore rilevate nei campioni fecali, 630Δerm e hpdC::CT hanno dimostrato pari capacità di colonizzazione iniziale
• A 7 giorni dall’infezione, i livelli di 630Δerm fecali sono risultati inferiori a quelli di hpdC::CT, suggerendo una differenza nella persistenza di colonizzazione tra i due ceppi
• A 4 giorni dal trattamento con vancomicina, i modelli infettati con hpdC::CT hanno invece mostrato un numero di spore inferiore rispetto alla controparte

C. difficile e alterazioni del microbiota intestinale

Considerando l’alterato profilo di colonizzazione dimostrato da hpdC::CT in fase di ricaduta e le proprietà batteriostatiche del p-cresolo nei confronti di determinate specie, è ragionevole supporre una possibile alterazione in termini di composizione batterica intestinale a favore della colonizzazione di C. difficile.

Per verificare questa ipotesi, i ricercatori hanno esaminato la composizione del microbiota intestinale dei vari gruppi principalmente attraverso tecniche di sequenziamento genico 16S rRNA e PCA (Principal component Analysis).

In seguito al solo trattamento con cefoperazone si è osservato che:

• La famiglia Lactobacillaceae domina il microbiota di modelli murini infettati con 630Δerm andando a comprendere circa il 40% di tutte le specie, seguita da Bacteroidetes
• La maggior parte delle famiglie batteriche caratterizzanti i modelli con hpdC::CT appartengono al phylum Proteobacteria
• La diversità batterica a 7 giorni di modelli infettati con hpdC::CT è superiore sia all’altro gruppo sia ai controlli

La somministrazione di vancomicina per indurre la ricaduta ha invece comportato:

• Significativa riduzione di diversità in tutti i gruppi, controlli compresi
• Aumento consistente e generale di Lactobacillaceae, genere Lactobacillus in particolare pari al 90% nei 630Δerm, 87% nei hpdC::CT e all’85% nei controlli
• Parziale ripresa di diversità batterica a 4 giorni, peculiare in ogni gruppo
• Incremento di espressione degli ordini Firmicutes, Bacillales e Clostridiales a 4 giorni nei modelli  630Δerm, di Proteobacteria, Betaproteobacteria e Burkholderiales invece in quelli hpdC::CT
• Un arresto di crescita dei Gram negativi più marcato

I trattamenti antibiotici hanno inoltre dimostrato un differente impatto in termini di funzionalità metabolica del microbiota intestinale a seconda del ceppo di infezione.

Effetti del p-cresolo sul microbioma umano

Dopo aver studiato gli effetti della somministrazione esogena di p-cresolo in vitro e in vivo, i ricercatori sono passati a valutarli in relazione alla componente batterica umana andando peraltro a confermare i risultati finora ottenuti.

A campioni fecali di donatori sani è stato quindi addizionato p-cresolo in due diverse concentrazioni, 0.1% e 0.3% rispettivamente, e, dopo 90 minuti, sono state valutate le percentuali di sopravvivenza relativa di varie specie in confronto a campioni senza il metabolita.

• I batteri anaerobi facoltativi hanno mostrato alta suscettibilità al p-cresolo a entrambe le concentrazioni, mentre i totalmente anaerobi e i fermentanti-lattosio solo a quella maggiore
• Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp., analogamente a quanto risultante in vivo, hanno invece dimostrato maggiore resistenza al p-cresolo nonostante, soprattutto alla concentrazione più alta, abbiano registrato un decremento

Inoltre, sulla base di ulteriori studi di attività condotti nell’ambito di questa ricerca, sembrerebbe che la capacità di resistenza al p-cresolo sia da correlare alla struttura della cellula batterica, della membrana in particolar modo.

Conclusioni

In conclusione dunque, la produzione di p-cresolo da parte di C. difficile consente al batterio in questione di competere attivamente con i commensali “buoni”, alterando la composizione e la diversità batterica del microbiota intestinale.

Considerando perciò l’importanza del p-cresolo nell’insorgenza e nel decorso dell’infezione da Clostridium difficile qui dimostrata, questo studio offre nuove basi per la ricerca di terapie focalizzate sulla modulazione della sua produzione al fine di diminuirne la virulenza e i conseguenti effetti per l’ospite.