La somministrazione orale di probiotici “camuffati” all’interno di una membrana estratta da lieviti e ricca di beta-glucani, strategia ideale per favorire la fagocitosi, ha mostrato un effetto positivo nella regolazione del microbioma intestinale.

L’azione è da ricondurre alla stimolazione della risposta immunitaria a livello delle placche di Peyer, ossia aggregati di follicoli linfonodali, con conseguente impatto su componente batterica, promozione dell’integrità della barriera e difesa contro patogeni o infezioni sistemiche.

È quanto si può riassumere dallo studio coordinato da Sisi Lin del Shanghai Cancer Institute (Cina), di recente pubblicato su Science Advances.

Intestino e sistema immunitario

L’eterogeneità e complessità del nostro microbioma, nonché il suo fondamentale ruolo (di quello intestinale soprattutto) nella salute dell’ospite sono ormai aspetti noti. Altrettanto conosciuti sono i possibili fattori in grado di alterarne l’equilibrio con conseguenti disturbi, sia a corto sia a medio-lungo termine, locali ed extra-sede.

Dieta, ambiente, stile di vita, farmaci, patologie preesistenti sono tra i principali. Capire come “neutralizzare” queste variabili (almeno in parte) è perciò di grande interesse nella medicina moderna e diversi sono gli approcci finora valutati, quasi tutti però con target il microbioma stesso e applicati per terapie a lungo decorso, pochi in prevenzione o trattamenti occasionali.

La plasticità e l’inter-variabilità del microbioma, unite alla (in alcuni casi) invasività dei trattamenti, richiedono quindi interventi più mirati e tollerabili.

Il sistema immunitario è uno stretto interlocutore del microbioma influenzandolo e venendone influenzato. Sfruttando questa correlazione bilaterale, i ricercatori hanno quindi sperimentato la possibilità di intervenire sul sistema immunitario per, a monte, raggiungere il microbioma intestinale proteggendolo da eventuali attacchi esterni e sostenendone il ruolo fisiologico.

Escherichia coli Nissle 1917 “camuffato” da lievito

Per farlo, probiotici vivi sono stati “camuffati” attraverso un processo di estrusione in membrane di lieviti fisiologicamente ricche di beta-glucani estremamente utili per facilitare l’entrata (fagocitosi) all’interno delle cellule target dell’epitelio intestinale, cellule M (microfold) in questo caso.

Dall’epitelio intestinale il probiotico è stato poi rilasciato all’interno delle placche di Peyer (target finale), con conseguente attivazione della risposta immunitaria mucosale. Ma vediamone più in dettaglio i vari passaggi.

Grazie a legami specifici  con il recettore Dectin-1, i lieviti con abbondante presenza di beta-glucani a livello di membrana sono efficacemente internalizzati all’interno di cellule M (cellule del tessuto linfoide associato a mucosa).

Questa loro caratteristica associata alla tecnica di estrusione, ossia di rivestimento batterico, ha permesso la formulazione di probiotici molto meglio assorbibili e, soprattutto, specifici per il target di interesse.

Il probiotico Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) è stato quindi rivestito di membrana estratta da cellule di lievito (YM) andando a ottenere un estruso denominato EcN@YM. La “qualità” dell’estruso è stata quindi verificata attraverso tecniche di microscopia e la sua eventuale tossicità con test in vitro (co-coltura con cellule Caco-2 dell’epitelio intestinali).

Prima di raggiungere il primo target, le cellule M, il probiotico deve poter superare indenne l’ambiente gastrointestinale. La resistenza dei beta-glucani espressi da EcN@YM è stata quindi testata in fluidi sia gastrici (SIG) sia intestinali (SIF) (simulazioni e in vivo) dimostrando che:

• in vitro, i beta-glucani hanno mostrato buona stabilità sia in SIG sia in SIF. Risultati analoghi per l’intera formulazione (EcN@YM) testata in SIF
• la membrana di rivestimento (YM) ha confermato la capacità di proteggere il probiotico in SIF fino a un’ora, tempo di inizio del suo rilascio
• maggiore stabilità e protezione sono stati poi confermati in vivo in varie sezioni gastrointestinali comparandone i livelli con il probiotico non estruso.

Una volta formulato, l’estruso dovrà poi essere incorporato nelle cellule di trasporto. Ancora una volta, test in vitro (camera di diffusione) e in vivo rispetto al probiotico non modificato ne hanno dimostrato il corretto uptake. Infatti:

• il numero di EcN@YM traslocate attraverso lo strato di cellule M differenziate da Caco-2 a tre ore è risultato cinque volte maggiore rispetto il singolo ceppo EcN, di circa 11 volte a sei ore supportando l’efficacia di uptake dell’estruso
• risultati analoghi in vivo. Dopo 1,5 ore dall’inoculazione le placche di Peyer (PP) dei modelli trattati con EcN@YM hanno mostrato una presenza probiotica significativamente maggiore rispetto alla controparte con solo EcN. Il loro accumulo ha poi dimostrato una buona permanenza essendo stato mantenuto fino a tre settimane.

Altro aspetto fondamentale, l’interazione di EcN@YM con il sistema immunitario.

• EcN è risultato presente nei linfonodi mesenterici (MLNs) solo 4 ore dopo la somministrazione orale, step precedente il passaggio a PP. Comparando però i livelli con EcN@YM se ne sono registrati, per quest’ultimo, valori circa 8 volte maggiori
• in termini di risposta immunitaria sono stati monitorati i livelli di  sIgA (secretory immunoglobulin A) rilasciati nei fluidi intestinali avendo dimostrato una precoce attivazione in presenza batterica e nelle cellule M. Rispetto al trattamento con solo EcN, la sola membrana YM ha mostrato di incrementare la produzione di sIgA anche se solo per quattro ore. La combinazione con il probiotico (EcN@YM) ha però rinforzato considerevolmente la risposta immunitaria, ma soprattutto a 7 giorni
• in conseguenza all’aumento di sIgA si è registrato un incremento anche di altri mediatori quali cellule dendritiche CD11c+, CD3+ T cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells, e IgA+ B cells, sia in PPs sia in MLNs. Citochine infiammatorie quali IL-6 o TNF-alfa hanno invece mostrato solo un temporaneo incremento per poi tornare a valori fisiologici, indicando una buona tolleranza alla formulazione.

Ma come EcN@YM è in grado di mantenere l’omeostasi del microbioma in seguito a insulti esterni? Per scoprirlo, dopo la somministrazione per sette giorni dell’estruso, i ricercatori hanno verificato la risposta all’inoculazione con patogeni (Salmonella) o indotta disbiosi. Modelli pretrattati con il solo probiotico EcN sono stati usati come controlli.

• nel gruppo controllo, il trattamento con EcN ha mostrato trascurabili effetti protettivi nei confronti del microbioma in termini di composizione. Analogo a modelli sani invece il profilo microbico del gruppo con EcN@YM
• con EcN@YM si è infatti osservato un decremento di Proteobacteria, Salmonella ed Escherichia-Shigella inclusi, con un parallelo aumento di Bacteroidetes, tra i ceppi simbionti principali suggerendo nel complesso un buon sostegno nella difesa contro i patogeni
• risultati analoghi nei modelli “manipolati”. Il singolo probiotico ha mostrato scarsi effetti nel ripristinare l’omeostasi contrariamente all’estruso che ha permesso un ritorno a un profilo microbico simile a condizioni fisiologiche.

Da ultimo, si è testata la capacità di EcN@YM nel prevenire il danneggiamento della barriera intestinale considerando il suo importante ruolo nel difendere a sua volta l’ospite dalla traslocazione batterica e alto rischio di infezioni sistemiche. Due modelli murini sono stati quindi trattati con il singolo probiotico o con l’estruso per 7 giorni prima dell’induzione di alterazioni della barriera intestinale e l’infezione con Salmonella o manipolazione batterica. Modelli sani sono invece stati considerati come controlli.

• a testimonianza del danno epiteliale, i livelli sistemici di lipopolisaccaridi (LPS), IL-6 e TNF-alfa hanno dimostrato un incremento nonostante nel gruppo EcN@YM sia stato notevolmente limitato rispetto alla controparte
• ridotta nel gruppo con EcN@YM anche la traslocazione di Salmonella sia in organi vicini sia periferici, PP e MLN incluse
• effetti analoghi nel modello sottoposto a manipolazione con conseguente sia alterata motilità intestinale sia funzionalità della barriera. Il pretrattamento con EcN non ha infatti protetto dalla successiva indotta alterazione. EcN@YM ha invece ridotto la permeabilità intestinale oltre che i livelli di LPS, IL-6 e TNF-alfa
• nello stesso modello, valutandone la traslocazione si è poi visto un accumulo di ceppi sia aerobi sia anaerobi in PP e MLN, processo non registrato con EcN@YM

Conclusioni

Per concludere dunque, l’incorporazione di probiotici (E. coli Nissle in questo caso) all’interno di membrane estratte da lieviti e ricche di beta-glucani permette non solo di proteggere il ceppo dall’ambiente gastrointestinale, ma anche di raggiungere in maniera target il sistema immunitario della mucosa intestinale attraverso il quale agire sull’omeostasi batterica e sulla funzionalità della barriera intestinale dall’interno.

Questo nuovo approccio apre quindi le strade a nuove tecniche di prevenzione e/o trattamento di disturbi correlati al microbiota intestinale.