Stato dell’arte
Data l’importanza del microbiota della cavità orale soprattutto per malattie del tratto oro-faringeo, le tecniche di indagine sono in aumento al fine di delineare un profilo microbico sempre più dettagliato.

Cosa aggiunge questo studio
Scopo di questa revisione è stato confrontare il ruolo e la validità, nonché le limitazioni e le prospettive future, di approcci analitici quali la metagenomica, l’analisi del 16S rRNA e la più recente “colturomica” nello studio del microbiota peri-impianto e periodontale.

Conclusioni
Benché non siano stati individuati studi di comparazione fra le tre tecniche prese in esame nell’ambito del microbiota orale, i passi avanti rispetto alle metodologie coltura-dipendenti sono stati notevoli. Considerate le limitazioni di ciascuna metodologia, la combinazione tra più tecniche sembrerebbe rappresentare la strategia migliore.

La metagenomica, l’analisi del 16S rRNA e, più di recente, la colturomica sono approcci analitici che sempre più spesso ricorrono nello studio del microbioma, anche quello della cavità orale. Infatti, l’indagine coltura-dipendente, benché abbia dato negli anni passati risultati interessanti, non è più sufficiente in quanto non consente di analizzare innumerevoli specie batteriche (e non).

Questi nuovi approcci “coltura-indipendenti” o “next generation sequence” (NGS) proprio perché in divenire e dalle grandi potenzialità possono essere varie e, spesso, portare a risultati differenti.

Leonardo Martellacci e colleghi dell’Università Cattolica del Sacro Cuore hanno perciò individuato in letteratura e analizzato gli studi di confronto fra questi nuovi approcci (metagenomica, 16S rRNA, colturomica), evidenziandone limitazioni e prospettive future. Tuttavia, nessuno dei 330 articoli individuati nella prima ricerca per parole chiave sui database di letteratura (Web of Science, Scopus, PubMed) ha soddisfatto i criteri di inclusione per il primo punto, ovvero il confronto fra le tre tecniche. La revisione si è quindi concentrata sulla caratterizzazione delle loro limitazioni e prospettive future.

Metagenomica e analisi del 16S rRNA

Roche454 pyrosequencing, Illumina HiSeq/MiSeq, ABI SOLiD e Ion Torrent sono tra le tecniche NGS più utilizzate e che hanno dato avvio alla metagenomica intesa come “lo studio basato sul genoma di comunità di microrganismi direttamente nel loro ambiente naturale” e alla più “targettizzata” analisi del 16S rRNA in grado di restituire “l’impronta genetica” di un determinato microrganismo. Entrambe, seppur con le relative limitazioni, hanno contributo all’avanzamento delle conoscenze individuando anche nuovi ceppi, batterici e non solo. Tra gli aspetti a favore, infatti, è stata riscontrata una notevole riduzione dei tempi di analisi e, in alcuni casi, della quantità di campione necessario, oltre a una descrizione più dettagliata dell’intero microbioma. Sulla base di questi approcci, per esempio:

• Persson et. al, Casado et. al e Patini et al., hanno dimostrato come Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Filifactor alocis siano associati a periodontite anche in assenza di infiammazione visibile
• Dabdoub et al. ha individuato un core di microbiota composto da 46 specie dei generi Streptococcus, Veillonella, Actinomices, Corynebacterium, Neisseria, Fusobacterium e Selenomonas; non sono invece presenti virus o archea
• Shchipkova et al., confrontando il microbiota di soggetti fumatori e non, ha individuato un arricchimento di Parvimonas, Campylobacter, Treponema, Bacteroides e Fusobacterium nei primi, di Streptococcus, Veillonella e Neisseria nei secondi
• dopo quello intestinale, il microbiota orale ha dimostrato la più elevata ricchezza batterica, ma limitata diversità soprattutto in situazioni di malattia (Zhou Y. et al.; Huse SM et al.)
• Mason et al. ha riscontrato una variabilità del microbiota orale correlato all’etnia e alla locazione geografica.

Le limitazioni riscontrate per entrambe le tecniche sono:

• l’impossibilità di distinguere tra microrganismi vivi e non;
• la difficoltà di calcolare il quantitativo di DNA necessario per l’analisi;
• la necessità di avere, per una corretta identificazione, sequenze di geni peculiari per una specie.

Per far fronte a questi e altri punti deboli, ha fatto il suo ingresso tra le tecniche di indagine anche la “colturomica” che, sfruttando differenti condizioni di coltura, punta a differenziare le specie batteriche mediante analisi di spettrometria di massa MALDI-TOF. Sebbene non sia stata ancora applicata al microbiota orale, questa tecnica consentirebbe un’ulteriore approfondimento nell’identificazione di microrganismi. I dati sembrano però fornire, almeno fino ad oggi, un profilo qualitativo ma non quantitativo.

Il panorama analitico è quindi vasto e in sviluppo. La combinazione di più tecniche, finora poco sfruttata, sembra tuttavia la strategia migliore per un’analisi dettagliata del microbiota, incluso quello orale.