Utilità e limiti dei test preclinici in vitro per predire la sopravvivenza dei probiotici in vivo

4 Aprile 2019 / di Enrico Stefano Corazziari

I probiotici sono definiti da WHO e dalla FAO come «Microrganismi vivi che, assunti in sufficiente quantità, esercitano effetti benefici sulla salute dell’ospite». Per poter svolgere la sua azione, una volta ingerito, il microrganismo probiotico deve sopravvivere all’azione dell’acido gastrico, della bile e degli enzimi pancreatici ed enterici e, finalmente, colonizzare l’intestino in quantità sufficiente ad esplicare attività eubiotica.

Studi di recovery e in vitro

Anche se l’unica valida dimostrazione che un probiotico sopravviva e colonizzi l’intestino sia quella di recuperarlo (recovery) intatto e vitale nelle feci, quasi tutti i prodotti disponibili in commercio promuovono le loro caratteristiche probiotiche sulla base di studi condotti in animali da esperimento, su campioni biologici ex vivo, o in vitro.

È, tuttavia, ragionevole che, prima di condurre studi appropriati di recovery in vivo, si voglia preliminarmente testare la potenzialità di sopravvivenza di un probiotico in vitro, purché siano rispettate le condizioni fisiologiche dell’ambiente gastrointestinale umano.

E proprio un’analisi condotta in vitro per verificare se probiotici presenti nel mercato italiano fossero confacenti alle norme di qualità previste da WHO e FAO (This investigation hence intends to clarify whether probiotics on the Italian market comply with these general quality requirements) ha messo in luce i limiti di un’analisi condotta in condizioni non fisiologiche e non assimilabili a quelle presenti nell’ambiente gastrointestinale dell’uomo (1).

Gli Autori hanno preso in esame dieci tra i probiotici più richiesti in Italia e li hanno esposti per oltre 30 minuti in vitro a contatto con soluzioni acide (pH 1,4-1,5) ed alcaline (pH 8,0) per simulare, rispettivamente, l’ambiente acido gastrico e quello intestinale più alcalino.

Prima di stabilire un valore di acidità o alcalinità compatibile con le normali condizioni ambientali nell’uomo è bene ricordare quali sono quelle presenti in condizioni fisiologiche.

Il pH gastrico

Il pH gastrico è diverso tra fondo e antro, varia con ritmo circadiano, ed è profondamente modificato dall’azione tampone dei pasti e dal reflusso duodenogastrico, prevalentemente notturno (2).

Misurazioni pH-metriche condotte per 24 ore hanno dimostrato che, a digiuno, il pH del fondo è superiore a 4,0 nel 7,8% del tempo, mentre nell’antro è superiore a 4,0 nel 45,4% del tempo (3).

Se poi consideriamo il pH intragatrico delle 24 ore con i pasti, esso si mantiene su valori superiori a 2 per circa due ore dopo ogni pasto e il cibo tende a tamponare di più il pH a livello del fondo, da dove l’acido viene prodotto e, per sua natura, più acido che dell’antro.

Anche di notte, per la posizione supina, il reflusso duodeno-gastrico modula, innalzandolo, il pH gastrico, maggiormente quello antrale (4).

Gli Autori hanno, invece, scelto di testare la sopravvivenza dei probiotici a pH 1,4-1,5, valori ben al di sotto di quelli che si ritrovano in fisiologia umana: addirittura valori di 1,4 sono al di sotto di quel range 1,5-3,5, riportato da loro stessi come valori di riferimento (peraltro inesatti) minimo e massimo del pH gastrico.

Gli stessi Autori sono consapevoli che l’esperimento di sopravvivenza è condotto in condizioni estreme tant’è che riportano nel loro testo «simulated gastric fluids, both characterized by a low pH (1.4–1.5), containing (USP) or not (ASTM) pepsin, in order to mimic an extremely harsh gastric environment», ma così agendo, nulla di quanto fatto può essere utilizzato per valutare il comportamento dei probiotici quando assunti dall’uomo.

Non è superfluo ricordare che il pH esprime il valore negativo del logaritmo a base 10 della concentrazione molare degli ioni idrogeno e che, quindi, una variazione di 1,0 unità di pH esprime una differenza di cento volte la concentrazione di ioni idrogeno, ed un pH di 1,4 ha una concentrazione di ioni idrogeno dieci volte superiore a quella del pH 1,5.

Tempi di esposizione all’ambiente acido gastrico

Anche i tempi di esposizione (30 e più minuti) dei probiotici all’ambiente simulato acido gastrico di pH 1,4-1,5 non hanno alcun riscontro in fisiologia umana.

La permanenza di un ingesto nello stomaco dipende dal tempo di svuotamento gastrico, che è essenzialmente rallentato dal volume e dal contenuto calorico degli ingesti presenti nello stomaco (6).

Il tempo di transito oro-duodenale di un probiotico assunto a digiuno con una minima quantità di liquido, di solito un sorso d’acqua, avviene nell’ordine di 5- 10 minuti perché l’ingesto non è calorico e non modifica, se non minimamente, il volume intragastrico.

Il tempo di transito oro-duodenale di un probiotico assunto al, o immediatamente dopo, pasto sarà equivalente a quello del pasto, ma, in questo caso, il pH intragastrico sarà di molto superiore ad 1,5 per l’effetto tampone del pasto stesso.  

Il pH intestinale

La scelta di pH 8,0 per simulare le condizioni ambientali intestinali non ha riscontro in fisiologia umana, tanto meno a livello duodenale-prima ansa digiunale, dove, come nella simulazione in vitro eseguita dagli Autori, i probiotici testati sono stati messi a contatto con sali biliari ed enzimi pancreatici.

Diversi studi hanno valutato il pH duodenale nell’uomo. In un primo studio il pH nei primi 10 cm del duodeno, dove entra la bile e il secreto pancreatico, varia da 2,0 a 5,0 a digiuno e da 1,7 a 4,3 nella terza ora postprandiale per raggiungere il valore di 5,0-6,0 alla giunzione duodeno digiunale (7).

Un secondo studio (8), che ha valutato il pH duodenale a digiuno, ha trovato valori oscillanti tra 6,9 e 7,5; un terzo studio (9) ha riscontrato valori di pH 6,3 a digiuno e 5,3 dopo pasto carneo.

A livello digiunale è stato riportato essere 5.97 +/- 0.07 in 15 soggetti di controllo sani (10) e valori analoghi 6.2 (±0.6) sono stati confermati in un altro studio (11).

Un terzo studio (12), che ha confermato in soggetti sani di controllo valori analoghi nel digiuno prossimale 5.6 ± 0.49, ha anche riportato i valori di pH del digiuno distale 6.2 ± 0.3, ileo prossimale 6.6 ± 0.3, ileo distale 6.8 ± 0.2 evidenziando che fino all’ileo terminale il pH del tenue non subisce variazioni significative e si trova ben al disotto del pH 8,0 utilizzato per valutare la sopravvivenza di probiotici in questo studio. Non esiste, quindi, alcuna evidenza che il pH dell’intestino tenue umano raggiunga e mantenga nel tempo il valore di 8,0.

Si dovrebbe anche considerare che i valori più elevati di pH nel tenue e poi nel colon vengono raggiunti in tratti intestinali dove non sono attivi né i sali biliari né gli enzimi pancreatici che erano invece aggiunti nel preparato a pH 8,0 utilizzato per testare la sopravvivenza dei probiotici.

Conclusioni

In definitiva, l’avere testato i probiotici in fluidi di simulazione gastrici e bilio-pancreatici a valori di pH non compatibili con quelli fisiologicamente presenti nell’organismo umano non consente di predire il comportamento di questi probiotici nel tratto gastroenterico dell’uomo.

Volendo quindi testare un probiotico in vitro le condizioni più vicine a quelle fisiologiche dovrebbero prevedere, considerando il valore medio di pH endoluminale e del tempo di residenza nei vari segmenti del tratto gastroenterico:

  • per l’ambiente gastrico, un’esposizione del prodotto a un pH di 2,0-3,0 per un tempo di 10 minuti se assunto a digiuno e un pH di 4,0 se assunto ai pasti;
  • per l’ambiente duodenale, un pH superiore a 4,0 per 5-10 minuti;
  • per l’ambiente digiunale, un pH di 6,0 per un periodo di 30 minuti;
  • per l’ambiente ileale, un pH 6,5-7,5 per periodi di 30-120 minuti.

Tuttavia, anche il più accurato studio che testi in vitro la capacità di sopravvivenza gastrointestinale di un probiotico non può pretendere di predire le ben più rilevanti funzioni per cui verrebbe utilizzato in vivo, ovvero di colonizzare, svolgere attività eubiotica e avere un effetto benefico sulla salute dell’uomo.

Per dimostrare queste funzioni sono necessarie dimostrazioni di recovery del prodotto vitale nelle feci, di analisi del microbiota e del relativo metaboloma e di studi clinici controllati che ne dimostrino l’efficacia e che solo pochi probiotici in Italia possono vantarsi di avere fatto.

Enrico Stefano Corazziari
Senior Consultant , Dipartimento di Gastroenterologia
Istituto Clinico Humanitas, Rozzano

Bibliografia:
Vecchione A, Celandroni F,Mazzantini D,Senesi S, Lupetti A and  Ghelardi E. Compositional quality and potential gastrointestinal behavior of probiotic products commercialized in Italy.Frontiers in Medicine. 2018 doi: 10.3389/fmed.2018.00059
van Herwaarden MA1, Samsom M, Smout AJ. 24-h recording of intragastric pH: technical aspects and clinical relevance.  Scand J Gastroenterol Suppl. 1999;230:9-16
WF Fackler, MF Vaezi & JE Richter. Ambulatory gastric pH monitoring: proper probe placement and normal values  APT 2001: 15: 1155-1162
Barlow AP, Hinder RA, DeMeester TR, Fuchs K. Twenty-four-hour gastric luminal pH in normal subjects: influence of probe position, food, posture, and duodenogastric reflux. Am J Gastroenterol. 1994 Nov; 89(11):2006-10.
Pallotta N, Cicala M, Frandina C, Corazziari E. Antro-pyloric contractile patterns and transpyloric flow after meal ingestion in humans Am J Gastroenterol. 1998 Dec;93(12):2513-22)
Tokatli M, Gülgör G, Elmacı SB, İşleyen NA, Özçelik F. In vitro properties of potential probiotic indigenous lactic acid bacteria originating from traditional pickles. Biomed Res Int (2015) 2015:8. doi:10.1155/2015/315819
Ovesen L, Bendtsen F, Tage-Jensen U, Pedersen NT, Gram BR, Rune SJ Intraluminal pH in the stomach, duodenum, and proximal jejunum in normal subjects and patients with exocrine pancreatic insufficiency. Gastroenterology. 1986 Apr;90(4):958-62
Woodtli W, Owyang C Duodenal pH governs interdigestive motility in humans. Am J Physiol. 1995 Jan; 268(1 Pt 1):G146-52.
Rune SJ, Viskum K  Duodenal pH values in normal controls and in patients with duodenalulcer. Gut. 1969 Jul; 10(7):569-71.
Rawlings JM, Lucas ML, Russell RI  Measurement of jejunal surface pH in situ by plastic pH electrode in patients with coeliac disease Scand J Gastroenterol. 1987 Apr; 22(3):377-84.
Aburub A1, Fischer M2, Camilleri M3, Semler JR4, Fadda HM Comparison of pH and motility of the small intestine of healthy subjects and patients with symptomatic constipation using the wireless motility capsule. Int J Pharm. 2018 Jun 10; 544(1):158-164. doi: 10.1016/j.ijpharm.2018.04.031. Epub 2018 Apr 17.
Lalezari D  Gastrointestinal pH profile in subjects with irritable bowel syndrome.
Ann Gastroenterol. 2012; 25(4):333-337.

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